酿酒酵母醛酮还原酶Gre2的结构与功能研究

论文摘要

在生物体内,存在多种醛酮类物质,它们往往是在机体收到外界压力胁迫产生的。它们往往能够改变机体的正常的代谢活动,或是直接对机体产生毒害作用。为了应对这种压力刺激的作用,生物机体内往往产生相应的对抗措施,减少压力作用导致的中间产物或具有毒害作用的代谢产物的积累。在这一过程中发挥作用的蛋白被称为应激蛋白。本文中所研究的酿酒酵母Gre2蛋白是一种应激蛋白,它是具有醛酮还原酶功能的氧化还原酶。氧化还原酶类一般分属于四个大的家族:长链醇脱氢酶家族,短链脱氢酶/还原酶家族（即SDR家族）,中链脱氢酶家族（MDR家族）和Aldo-Keto还原酶家族（即AKR家族）。由Gre2的一级序列和活性位点的保守性可把Gre2蛋白归类为SDR家族的成员。Gre2蛋白质在压力诱导的情况下表达量大幅度升高。作为醛酮还原酶它可以催化多种二酮类、α-酮酯、β-酮酯、脂肪族和芳香族醛类、脂肪族酮类和羟基酮类发生还原反应,改变酿酒酵母体内的一些微环境,起到如抑制酵母出丝、解毒的作用。此外,Gre2能催化手性化合物的生成,它有可能在手性药物或手性化合物的生产中起着重要作用。在本文中,我们成功构建了Gre2的重组质粒,经表达和纯化后得到了Gre2的重组蛋白,并对其进行了晶体的初筛和优化。最终收集到了Gre2的apo form和Gre2与NADPH复合物的两套X-射线晶体衍射数据。我们采用分子置换法解析了Gre2和Gre2-NADPH的结构。其三维结构分为两个结构域,N-端结构域主要由Rossmann折叠构成,C-端结构域主要是由α+β的折叠模式。通过Gre2 apo form的结构与Gre2-NADPH复合物的结构的比较,我们发现,NADPH进入Gre2蛋白质分子的结合沟槽以后,Gre2两个结构域相互靠近,使得结合NADPH的中间沟槽变窄,这种“Induce fit”效应帮助蛋白质形成了更完善的底物结合口袋。同时NADPH上的烟酰胺环位于口袋的底部,也属于底物结合口袋的一部分。结合口袋的形成可以使得Gre2分子更容易的结合底物小分子,有利于催化反应的发生。Gre2作为SDR家族的成员,其催化机制与SDR其它家族成员是非常相似的。Gre2拥有一个保守的催化三联体结构,它是由Ser126-Tyr165-Lys169三个氨基酸残基组成的。其中126位丝氨酸、165位酪氨酸可以与底物分子形成氢键,并在反应过程中提供质子,169位的赖氨酸残基则为催化反应的发生提供了一个碱性的环境。通过与SDR家族的其它同源结构的比较,我们发现Gre2相对而言具有较大的底物结合口袋,这一特点有利于Gre2分子结合更多种不同的底物,这为Gre2的底物多样性提供了结构上的解释。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 酿酒酵母醛酮类还原酶 Gre2 的研究背景
• 1.1.1 酿酒酵母的背景知识简介
• 1.1.2 醛酮类物质及其还原反应简介
• 1.1.3 酿酒酵母的压力应答系统
• 1.1.4 Gre2 是一类重要的醛酮类还原酶
• 1.2 酿酒酵母中 Gre2 蛋白的研究进展
• 1.2.1 在酿酒酵母中Gre2 蛋白发挥多种醛酮类还原酶的功能
• 1.2.2 Gre2 蛋白质在体内发挥丙酮醛的解毒作用
• 1.2.3 Gre2 通过发挥异戊醛还原酶的作用抑制酵母出丝
• 1.2.4 Gre2 通过参与麦角固醇的合成
• 1.2.5 Gre2 催化（S）-3-氯-1-苯基-1-丙醇的合成
• 1.2.6 Gre2 参与（2S，5S）-2,5-己二醇的生物合成
• 1.2.7 Gre2 拥有保守的催化三联体
• 1.2.8 Gre2 属于SDR 家族的成员
• 1.3 参与的其它工作的相关背景简介
• 1.3.1 酿酒酵母中的其它靶标
• 1.3.2 蓝藻的两个物种（Microcystis aeruginosa PCC 7806 和 Anabaena sp. PCC 7120）中的其它靶标
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 常用菌株
• 2.1.2 常用质粒
• 2.1.3 常用酶类
• 2.1.4 常用晶体学初筛条件
• 2.1.5 常用小分子试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 相关分子克隆方法
• 2.2.2 目的蛋白的检测表达与获取
• 2.2.3 目的蛋白晶体的筛选与优化
• 2.2.4 数据收集与晶体结构解析
• 2.2.5 实验中用到的其它方法
• 第三章 Gre2 蛋白研究的结果与讨论
• 3.1 Gre2 的实验结果
• 3.1.1 Gre2 的分子克隆与检测表达
• 3.1.2 Gre2 重组蛋白的大量表达与纯化
• 3.1.3 Gre2 的晶体初筛与优化
• 3.1.4 Gre2 的晶体衍射数据的收集和数据处理
• 3.2 Gre2 的晶体结构描述
• 3.2.1 Gre2 的apo form 的晶体结构
• 3.2.2 Gre2 与NADPH 复合物的晶体结构
• 3.2.3 Gre2 apo form 结构与Gre2-NADPH Complex 结构的比较与分析
• 3.2.4 Gre2 具有保守Ser-Tyr-Lys 催化三联体结构
• 3.3 Gre2 的酶学活性体系及Km 值测定条件的初步摸索及分析
• 3.3.1 Gre2 的酶学活性体系及Km 值测定条件的初步摸索
• 3.3.2 Gre2 的酶学相关的分析
• 第四章 其它工作的结果与讨论
• 4.1 酿酒酵母中其它蛋白的实验结果及分析
• 4.1.1 Ydl124W 的实验结果与讨论
• 4.1.2 Dph1 和Dph2 的实验结果与讨论
• 4.2 蓝藻中其它蛋白的实验结果及分析
• 4.2.1 蓝藻所选蛋白靶标的分子克隆、检测表达及其分析
• 4.2.2 目的蛋白159028653 和all4018 的大量表达和纯化及结果分析
• 4.2.3 目的蛋白159028653 和all4018 的晶体初筛及结果分析
• 4.2.4 目的蛋白all4018 的蛋白酶解及结果分析
• 参考文献
• 附录1 常规试剂配方
• 附录2 质粒小量抽提
• 附录3 酵母基因组的抽提步骤
• 附录4 细菌基因组的抽提步骤
• 附录5 感受态细胞的制作
• 附录6 引物设计遵从的一般原则
• 致谢