郁金香ACC氧化酶基因RNAi载体的构建与转化的初步研究

论文摘要

郁金香（Tulipa gesneriana L.）是世界著名切花之一,也广泛应用于花坛、庭院和室内绿化中,深受各国人民的喜爱。但是郁金香花期不长,延长其花期对延长观赏期和调节流通有重要作用。如何延长花朵的寿命已成为近年来专家们研究的主要课题之本研究通过克隆郁金香ACC氧化酶（ACO）基因片段,将其构建成带内含子的发卡结构的RNAi植物表达载体,以求引起郁金香ACC氧化酶基因的沉默,通过这种调控郁金香中乙烯表达的方法来控制花朵的衰老,从而延长郁金香的花期,并建立起RNAi技术平台。主要进行以下三个方面的研究：1、ACO基因片段的克隆及其植物RNAi表达载体的构建根据郁金香ACO基因序列,设计一对特异引物,以郁金香品种‘Los Angeles’的花瓣cDNA为模板,扩增出郁金香ACO基因片段,将其连接到Pucm-T载体上,对序列测定结果进行分析显示ACO基因片段克隆成功。将ACO基因片段切下先后通过反向和正向分别连接到中间载体pBSin的内含子两端,构成了ACO基因的带内含子的发卡结构（ihp结构）；再将发卡结构连接到二元载体pCAMBIA35S-1301上,经酶切检测及测序分析,成功地构建了含ACO基因发卡结构的植物表达载体。2、郁金香组织培养的试验研究以郁金香的鳞片、花茎、花托、花瓣、花药和雌蕊为外植体,进行了系统地组织培养研究,结果发现,郁金香可以有直接器官发生和间接器官发生两种途径形成再生植株。通过研究,筛选出了适宜的培养基激素配比,成功地获得了郁金香组织培养再生植株。初代培养阶段,以郁金香花茎、花托和雌蕊为最佳外植体选择,污染率在8.6%以下,愈伤组织的诱导率高达72%-100%。适合郁金香的花茎、花托和雌蕊等外植体愈伤组织的诱导和增殖培养的培养基是MS+0.5 mg·L-1 2,4-D,适合这些外植体不定芽的诱导和愈伤组织分化的培养基是MS+0.2 mg·L-12,4-D+6.0 mg·L-1ZT。生根阶段,最适培养基为1/2 MS+1.0 mg·L-1 NAA+2.0 g·L-1A.C。3、含ACO基因片段的RNAi表达载体的遗传转化采用冻融法将RNAi表达载体导入了农杆菌GV3101菌株,对郁金香组培苗和愈伤组织初步进行了含ACO基因片段的RNAi表达载体的遗传转化。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 绪言
• 1.1 郁金香花卉及衰老生理
• 1.1.1 郁金香花卉
• 1.1.2 烯与郁金香切花衰老的关系
• 1.2 ACC氧化酶基因的研究
• 1.2.1 ACC氧化酶及其基因的研究
• 1.2.2 ACC氧化酶基因工程研究进展
• 1.3 RNAi技术的研究
• 1.3.1 RNAi的概念及其发现
• 1.3.2 RNAi的作用机理
• 1.3.3 RNAi的作用特点
• 1.3.4 hpRNA介导的基因沉默
• 1.3.5 RNAi技术在植物基因工程中的研究进展
• 1.4 郁金香的组织培养研究进展
• 1.4.1 培养基
• 1.4.2 外植体来源部位
• 1.4.3 外源激素、活性炭及暗处理等对郁金香组织培养的影响
• 1.5 研究的背景、目的意义,研究内容和技术路线
• 1.5.1 研究的背景
• 1.5.2 本研究的项目依托和研究的意义
• 1.5.3 主要研究内容
• 1.5.4 主要技术路线
• 2 郁金香ACO基因RNAi载体的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 郁金香ACC氧化酶基因片段的克隆
• 2.2.2 植物表达载体的构建
• 2.3 讨论
• 2.4 本章小结
• 3 郁金香组织培养的试验研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 诱导分化培养
• 3.2.2 继代增殖培养
• 3.2.3 生根培养
• 3.3 讨论
• 3.3.1 外植体的选择对郁金香组织培养的影响
• 3.3.2 生长调节剂对郁金香组织培养的影响
• 3.4 本章小结
• 4 根癌农杆菌介导的RNAi表达载体的初步转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.3 郁金香幼苗和愈伤组织对Hyg的敏感性实验
• 4.1.4 转化体的筛选
• 4.2 结果与分析
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小结
• 结论
• 建议与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录一: MS培养基成分组成
• 附录二:攻读学位期间的主要学术成果
• 致谢