稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13和MgATG17的功能分析

论文摘要

稻瘟病菌导致的稻瘟病是影响水稻产量和质量的重要因素。稻瘟病菌具有典型的生活史和侵染循环,被认为是研究丝状真菌分子生物学和致病机理的理想模式菌。稻瘟病菌基因组全序列的得出,为稻瘟病菌基因功能研究提供了工具,使得稻瘟病菌日益成为研究及分析寄主和病原物互作机理的重要模式菌。研究稻瘟病菌的基因功能及其与寄主的相互作用是寻找新的防病途径的关键,具有重要的科学意义。细胞自噬,是真核生物中普遍存在的进化上保守的过程。细胞自噬是一种依赖于溶酶体或液泡的降解细胞胞质内容物的途径。在稻瘟病菌中,细胞自噬相关基因在附着胞形成和分生孢子产生、萌发以及侵染等过程中都发挥着重要的作用。研究稻瘟病菌细胞自噬相关基因的功能,对于了解稻瘟病菌致病机理以及预防有重要的作用。本研究在稻瘟病菌基因组数据库中通过与酵母的同源序列比对,得到稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13、MgATG17。利用同源重组的方法,研究稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13、MgATG17的功能。获得敲除突变体△mgatg11、△togatg13、△mgatg17.△△mgatg17mgatg11、△△mgatg17mgatg13;进行突变体的表型分析,以及绿色荧光蛋白GFP与稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13、MgATG17分别融合的分析。稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13、MgATG17单独缺失时对稻瘟病菌的菌落形态、产孢量以及致病性等影响不显著,但是当基因MgATG11、MgATG17共同缺失或基因MgATG13、MgATG17共同缺失时对稻瘟病菌的致病性和产孢量等有显著的影响。本研究中首次研究发现了稻瘟病菌细胞自噬过程相关的基因MgATG11、MgATG17的共同缺失和基因MgATG13、MgATG17的共同缺失可导致稻瘟病菌产孢量降低,孢子萌发推迟,对于水稻和大麦的致病性减弱。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1 稻瘟病菌概述
• 1.1 稻瘟病菌的侵染循环
• 1.1.1 稻瘟病菌孢子的传播和萌发
• 1.1.2 稻瘟病菌附着孢的形成
• 1.1.3 稻瘟病菌侵染栓形成和侵入
• 1.1.4 稻瘟病菌侵入后的菌丝分化与扩展
• 1.1.5 稻瘟病菌侵入后的产孢与再侵染
• 1.2 稻瘟病菌基因组草图的绘制及实验室研究
• 1.3 稻瘟病菌致病相关基因
• 1.4 稻瘟病菌的防治
• 2 细胞自噬概述
• 2.1 酵母中细胞自噬发生的分子机制
• 2.1.1 酵母中细胞自噬的诱导
• 2.1.2 物质（细胞自噬作用对象）的选择和包装
• 2.1.3 自噬泡的成核过程
• 2.1.4 自噬泡的延伸和完成
• 2.1.5 复原
• 2.1.6 自噬泡的融合
• 2.1.7 自噬泡的分解
• 2.2 高等真核生物细胞自噬发生的分子机制
• 2.3 压力诱导的分化和发育中的细胞自噬现象
• 2.4 发育细胞死亡中的细胞自噬
• 2.5 正常发育过程中细胞自噬基因的作用
• 2.6 细胞自噬和细胞生长控制
• 2.7 细胞自噬做为抗衰老机制
• 3 本研究的意义和内容
• 第二章 材料和方法
• 1 试验菌株
• 1.1 大肠杆菌菌株
• 1.2 稻瘟病菌菌株
• 1.3 农杆菌菌株
• 2 实验植物
• 3 培养基
• 3.1 LB培养基
• 3.2 SOB培养基
• 3.3 CM培养基
• 3.4 用于稻瘟病菌的单孢分离的水琼脂培养基
• 3.5 OMA燕麦培养基
• 3.6 农杆菌诱导培养基
• 4 抗生素的配置
• 5 菌株的保存和培养
• 6 PCR
• 6.1 常规PCR
• 6.2 LD-PCR
• 7 序列测定
• 8 DNA分析
• 8.1 DNA的琼脂糖电泳
• 8.2 DNA片段的凝胶回收基因组
• 8.3 DNA酶切
• 8.4 DNA酶切片段的去磷酸化
• 8.5 酶链接反应
• 9 E.Coli DH5a感受态细胞的制备
• 10 大肠杆菌转化
• 11 蓝白斑筛选
• 12 质粒的提取
• 12.1 小量质粒DNA的提取
• 12.2 CTAB法提取质粒
• 12.3 中量质粒DNA提取
• 13 农杆菌的冻融法转化
• 14 稻瘟病菌的T-DNA转化
• 15 稻瘟病菌基因组DNA提取
• 15.1 稻瘟病菌菌丝的收集
• 15.2 CTAB法提取稻瘟病菌基因组DNA
• 16 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交（DIG）
• 16.1 所需准备的试剂
• 16.2 DIG-DNA标记
• 16.3 基因组DNA的消化、电泳和变性
• 16.4 DNA转膜
• 16.5 Southern杂交过程
• 16.6 免疫显色
• 17 稻瘟病菌突变体的表型分析
• 17.1 稻瘟病菌产孢量分析
• 17.2 稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率分析
• 17.3 稻瘟病菌大麦离体接种
• 17.4 稻瘟病菌水稻苗喷雾接种
• 17.5 荧光表达的观察
• 第三章 结果与分析
• 1 稻瘟病菌细胞自噬相关基因MgATG11、MgATG13、MgATG17
• 2 基因敲除载体的构建
• 3 突变子的获得
• 4 基因互补载体的构建
• 5 突变体表型分析
• 5.1 突变体的菌落形态
• 5.2 突变体的生长速度
• 5.3 产孢量
• 5.4 孢子萌发和附着胞形成延迟
• 6 致病性分析
• 6.1 大麦离体接种
• 6.2 水稻喷雾接种
• 7 基因的细胞定位
• 7.1 融合载体的构建
• 7.2 荧光观察
• 第四章 试验总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 附录一 本研究所用引物和酶切位点