论文摘要
背景与目的非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD）是一类肝组织学改变与酒精性脂肪肝病相似但无过量饮酒史的临床病理综合症,一般认为它是一种遗传-环境-代谢应激相关性疾病。在西方国家,NAFLD的人群患病率高达20%-40%,在我国近10年来增长迅速,已成为我国最常见的肝病之一。有关NAFLD的病因学、预防和治疗已经成为目前的研究热点。NAFLD的发病机制尚未完全阐明,胰岛素抵抗（IR）被公认为是NAFLD发生的主要病理生理学机制之一,而脂联素及其受体基因的多态性与IR、胰岛素代谢的不同表现性密切相关,在体内具有拮抗IR的作用,外源性给与脂联素可改善糖耐量异常,防止高脂饮饲诱导IR。有研究表明激活p38MAPK信号通路介导了脂联素引发的游离脂肪酸氧化和葡萄糖摄入过程。p38MAPK能活化过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）,而PPARα可直接促进肝及巨噬细胞中脂蛋白脂酶（1ipoprotein lipase ,LPL）基因的表达。从而提示脂联素的异常在NAFLD的发病机制着重要的作用,而p38MAPK信号通路及LPL可能是脂联素发挥作用的主要介导因子。但迄今为止,有关采用脂肪变肝细胞模型来探索脂联素在NAFLD发生中的作用,及p38MAPK、LPL介导脂联素信号机制的研究,国内、外鲜见文献报导。因此,本研究利用油酸诱导的脂肪变肝细胞模型,并采用RT-PCR、免疫印迹法等方法观察了脂联素对体外培养脂肪变肝细胞p38MAPK、LPL表达及其生化指标的影响,旨在初步阐明脂联素在NAFLD的发病机制的作用及其信号转导机制,进而为NAFLD的临床防治提供新思路。方法:采用正常成人L- 02肝细胞株,随机分为3组。①A组:正常对照组;②B组:油酸诱导组,正常培养基加油酸进行细胞培养;③C组:油酸联合脂联素组,正常培养基加油酸及脂联素进行细胞培养。采用油酸诱导L- 02肝细胞株建立肝细胞脂肪变性模型;采用油红O染色观察各组肝细胞脂滴变化的情况;采用RT-PCR法检测各组脂蛋白酯酶（LPL）mRNA的表达;采用Western印迹法检测各组p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）及LPL蛋白的表达;采用生化试剂盒检测各组肝细胞内甘油三酯（TG）的含量及培养液中ALT、AST水平。结果:1、油酸可诱导L- 02肝细胞株脂肪变性,能成功建立肝细胞脂肪变细胞模型。在正常对照组,通过油红O染色未观察到橘色脂滴,细胞呈梭形,排列紧密,细胞核清晰可见;在油酸诱导组,随培养时间的增长,肝细胞脂肪变的程度呈加重的趋势,培养24小时后可见肝细胞内有少量橘色脂滴,脂变率（11.04±1.84）%;48小时有较多橘色脂滴,脂变率（34.96±6.98）% ; 72小时后则聚集了大量橘红色脂滴,脂变率（74.83±12.41）%,且上述3个培养时相点脂变率的比较,差异有统计学意义（P<0.01）。在油酸联合脂联素组,与油酸诱导组对应时相点比较,培养24小时后肝细胞脂变率无明显差异（P>0.05）,但培养48小时、72小时后其脂变率较油酸诱导组明显降低（分别为（29.89±7.13） %、（38.47±6.94） %,P<0.05）。2、各组肝细胞内TG含量的比较在油酸诱导组、油酸联合脂联素组,随着培养时间延长,细胞内TG含量均有增高的趋势,油酸诱导组各时相点进行组内比较有显著的统计学差异（P<0.01）。与油酸诱导组对应时相点比较,培养48小时,72小时后油酸联合脂联素组细胞内TG含量明显降低（P<0.05）。与正常对照组相对应的各时相点比较,油酸诱导组、油酸联合脂联素组TG含量均明显增加（P<0.01）。3、各组培养液中ALT、AST含量的比较在油酸诱导组、油酸联合脂联素组,随着培养时间延长,培养液中ALT、AST含量均有增高的趋势,油酸诱导组各时相点进行组内比较有显著的统计学差异（P<0.01）。与油酸诱导组对应时相点比较,培养48小时,72小时后油酸联合脂联素组细胞内TG含量明显降低（P<0.01）。与正常对照组相对应的各时相点比较,油酸诱导组、油酸联合脂联素组ALT、AST含量均明显增加（P<0.01）。4、各组肝细胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达的变化在培养24小时、48小时、72小时后,正常对照组、油酸诱导组、油酸联合脂联素组p38MAPK蛋白均有明显表达,但三组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。在培养的各时相点,油酸诱导组、油酸联合脂联素组p-p38MAPK蛋白有一定程度的表达,而正常对照组无表达。油酸诱导组72小时与24、48小时比较明显增高（P<0.01）;油酸联合脂联素组各时相点进行组内比较无统计学差异（P>0.05）,但与油酸诱导组72小时比较,油酸联合脂联素组p-p38MAPK蛋白显著降低（1.03±0.06 vs. 2.87±0.16,P<0.01）5、各组LPLmRNA表达的比较在油酸诱导组,LPLmRNA在培养各时相点后有一定程度的表达,72小时与24、48小时比较有统计学意义（P<0.05）。在油酸联合脂联素组,各时相点LPLmRNA均有表达,随着培养时间延长,其表达呈上升趋势,各时相点间比较有统计学意义（P<0.01）,且与油酸诱导组相对应的各时相点比较,差异亦有统计学意义（P<0.01）。6、各组LPL蛋白表达的比较:在油酸诱导组,LPL蛋白在培养后各时相点后有一定程度的表达,72小时与24、48小时比较有统计学意义（P<0.05）。在油酸联合脂联素组,各时相点LPL蛋白均有表达,随着培养时间延长,其表达呈上升趋势,各时相点间比较有统计学意义（P<0.01）,且与油酸诱导组相对应的各时相点比较,差异亦有统计学意义（P<0.01）。结论:1、脂联素可改善体外培养肝细胞脂肪变的程度。2、脂联素可明显降低脂肪变肝细胞p-p38MAPK蛋白表达,促进其LPL的表达,改善脂肪变肝细胞的生化指标,提示脂联素在非酒精性脂肪性肝病的发展过程中起着重要的作用。3、p38MAPK信号通路及LPL可能是脂联素发挥作用的重要因子,参与了肝细胞脂肪变的信号传递过程。
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标签：非酒精性脂肪性肝病论文; 脂联素论文; 脂肪变肝细胞模型论文; 油酸论文; 脂蛋白酯酶论文;