牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌多重PCR检测方法的建立及应用

论文摘要

目前,乳品安全事件频发,这其中相当一部分是由于乳中致病菌污染所引起的。而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌又是牛乳中引起人中毒的主要致病菌。因此,针对这3种细菌及其毒素的快速检测方法和技术一直是研究的热点。其中,PCR技术因具有高度的特异性、高效性及灵敏性而被广泛应用。本实验从牛乳中分离出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌菌株,然后对金黄色葡萄球菌（ATCC25923）的nuc基因、大肠杆菌（ATCC25922） 16S-23S rRNA基因和产气荚膜梭菌（ATCC13124）cpa基因进行PCR扩增,同时也对从乳中分离的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和沙门氏菌等菌株进行PCR扩增,通过是否扩增出目的条带来验证nuc、16S-23S rRNA和cpa这3种基因分别在检测金黄色葡萄菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌时是否具有特异性。最后,对PCR扩增产物进行测序,再将测序结果分别与Genbeank中V01281;CU928160.2和L43546.1标准序列进行比对,三者的同源性都达到99.50%以上,证明这3对引物有很好的特异性。在试验中,通过不断优化影响多重PCR反应的各种因素,最终确定了本实验最佳反应条件为:Mg2+ （25 mmol ） 1.5μL;引物浓度分别为金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌80 nmol/L,大肠杆菌40 nmol/L; dNTP（2.5 mmol） 2μL;Taq DNA聚合酶（2.5 U） 0.5μL。循环参数为:94℃预变性7 min;94℃变性30 s;55℃退火30 s;71℃延伸1 min 30 s;71℃延长延伸5 min;30个循环次数。在最佳实验条件下,3种细菌检测的灵敏性都达到了l0 cfu/mL;本实验对人工污染的巴氏乳进行了应用性检测,当上述3种细菌在牛乳中含量达102cfu/mL,本实验建立的检测方法可以在6 h内检测出。通过多重PCR扩增,验证了nuc、16S-23S rRNA、cpa 3种基因分别在检测牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌实验中的特异性,通过不断优化各种反应条件来提高PCR检测的灵敏性和准确性。通过对市售牛乳样品的应用性检测,证明将nuc、16S-23S rRNA、cpa作为靶基因的多重PCR检测方法,在检测牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌时的可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌检测研究进展
• 1.1 牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌的检测研究
• 1.1.1 金黄色葡萄球菌的研究
• 1.1.2 大肠杆菌的研究
• 1.1.3 产气荚膜梭菌的研究
• 1.2 牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌检测方法概述
• 1.2.1 传统检测方法
• 1.2.2 快速检测方法
• 1.3 PCR 技术原理及进展
• 1.3.1 PCR 技术原理
• 1.3.2 多重PCR 特点
• 1.3.3 多重PCR 应用于细菌检测的研究
• 1.4 研究目的和意义
• 试验研究
• 第二章 牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌的分离
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 牛乳中金黄色葡萄球菌株的分离
• 2.2.2 牛乳中大肠杆菌菌株的分离
• 2.2.3 牛乳中产气荚膜梭菌菌株的分离
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 金黄色葡萄球菌的分离结果
• 2.3.2 大肠杆菌的分离鉴定结果
• 2.3.3 产气荚膜梭菌的分离鉴定结果
• 2.4 讨论
• 2.4.1 乳中金黄色葡萄球菌菌株的分离
• 2.4.2 乳中大肠杆菌菌株的分离
• 2.4.3 乳中产气荚膜梭菌菌株的分离
• 2.5 小结
• 第三章 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌的PCR 检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 细菌的培养
• 3.2.2 模板DNA 的提取
• 3.2.3 引物设计
• 3.2.4 多重PCR 反应条件的优化
• 3.2.5 多重PCR 反应的特异性检测
• 3.2.6 PCR 反应的敏感性检测
• 3.2.7 多重PCR 反应产物检测
• 3.2.8 模板的不同提取方法比较
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 单一的PCR 检测结果
• 3.3.2 PCR 产物测序结果
• 3.3.3 多重PCR 反应条件的优化结果
• 3.3.4 多重PCR 反应特异性结果
• 3.3.5 单一PCR 扩增的敏感性结果
• 3.3.6 多重PCR 扩增的敏感性结果
• 3.3.7 不同的模板提取方法的比较结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 多重PCR 各种反应参数优化
• 3.4.2 特异性及敏感性分析
• 3.4.3 DNA 模板的提取方法
• 3.5 小结
• 第四章 多重PCR 方法检测牛乳中三种致病菌的实用性测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 主要培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 确定单一PCR 和多重PCR 对人工污染牛乳的检出限
• 4.2.2 多重PCR 方法与常规方法同时检测实际样品进行对比
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 人工污染牛乳测定检出限
• 4.3.2 多重PCR 方法与常规方法同时检测实际样品进行对比
• 4.4 讨论
• 4.4.1 人工污染牛乳测定检出限
• 4.4.2 与传统检测方法的比较
• 4.4.3 假阳性问题
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介