Riboswitch cDNA体外组装及相关文库构建

论文摘要

Riboswitch称为核糖开关,广泛存在于各种生物体内,可以认为是一类对小分子代谢物敏感的结构RNA,通过结合小分子代谢物在转录与翻译水平调控基因表达。它们通常位于mRNA的5’-非翻译区（5’- untranslated regions UTR）,不编码蛋白质,可以不依赖任何蛋白因子而直接结合小分子代谢物,继而发生构象重排,影响该mRNA的活动,调控小分子代谢物相关蛋白的表达。特异性与之结合的小分子代谢物一般为赖氨酸（Lysine）,黄素单核苷酸（flavin mononucleotide, FMN）,硫胺素焦磷酸（Thiamine pyrophosphate,TPP）,甘氨酸（glycine）,维生素B12氰钴铵（Cobalamin）等,其中与小分子结合的区域称为适配体结构域（aptamer domain,AD）。合成生物学的发展使得基因的人工合成变为可能。由于利用传统的碱基按序合成的方法来合成各种预期目的基因或者基因组序列既浪费时间又浪费资金,并且合成的目标序列有着很高的出错率,同时在多元平行构建基因的过程中,需要大量合成短的寡核苷酸（oligos）。随着科技的发展,微流体芯片技术的应用可以使我们平行合成寡核苷酸的过程变的相对简单与高效。由此可使得人工合成基因的过程简化为连接组装寡核苷酸片段。本论文以可程序控制的微流体PicoArray芯片平行合成的多元Riboswitch寡核苷酸（这些多元寡核苷酸经过人为设计和改良）为材料,通过扩增回收纯化,混合成为寡核苷酸混合物（OligoMix）,酶切纯化,连接与组装,PCR扩增,电泳检测等过程组装全长的Riboswitch基因。通过对合成目的基因与载体的连接,转化,克隆,提取质粒,进而对体外组装结果进行验证。通过质粒抽提,PCR,目的片段的回收纯化与检测,含量检测,获取Riboswitch目的基因的相关数据。将Riboswitch文库中DNA分子所对应的RNA序列进行M-fold二级结构折叠预测。通过文献查阅,按照配体的不同对Riboswitch分类,进而给出与配体结合的Riboswitch分子的保守区域与保守区域的二级结构折叠图像。依据配体的不同,结合Riboswitch DNA相关数据与二级结构折叠预测和适体保守区域分析,构建相应的Riboswitch文库,为后续的Riboswitch结构与功能研究奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 合成生物学与Riboswitch 相关研究
• 1 合成生物学
• 1.1 合成生物学概念
• 1.2 合成生物学的研究进展
• 1.3 合成生物学的研究意义
• 1.4 合成生物学面临的发展机遇与现实困难
• 1.4.1 合成生物学在基因合成方面的优势
• 1.4.2 合成生物学发展中的现实困难
• 2 核糖开关
• 2.1 核糖开关的研究历史
• 2.2 核糖开关结构特点
• 2.2.1 核糖开关结构
• 2.2.2 核糖开关与配体的结合特点
• 2.3 核糖开关的适体与配体
• 2.4 核糖开关基因调控
• 2.4.1 转录阶段表达调控机制
• 2.4.2 翻译阶段表达调控机制
• 2.5 核糖开关分类
• 2.5.1 核苷酸类核糖开关
• 2.5.1.1 Purine-Riboswitch
• 2.5.1.2 Adenine-Riboswitch
• 2.5.2 氨基酸类核糖开关
• 2.5.2.1 SAM-Riboswitch
• 2.5.2.2 Lysine-Riboswitch
• 2.5.3 维生素类核糖开关
• 2.5.3.1 TPP-Riboswitch
• 2.5.3.2 FMN-Riboswitch
• 2.5.3.3 Ado-Cbl-Riboswitch
• 3 前景
• 第二章 实验方案设计
• 1 实验目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程图
• 第三章 由寡核苷酸到全长Riboswitch 序列的合成
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 1.3.1 Amp Stock（100 mg/ml）
• 1.3.2 IPTG Stock（24 mg/ml）
• 1.3.3 X-Gal（20 mg/ml）
• 1.3.4 LB/Amp 液体培养基（500 ml）
• 1.3.5 质粒提取试剂
• 2 方法
• 2.1 Riboswitch OligoMix PCR
• 2.1.1 Riboswitch OligoMix 扩增条件的优化
• 2.1.2 PCR 产物纯化
• 2.2 OligoMix 酶切
• 2.3 MlyⅠ酶切后OligoMix 组装
• 2.3.1 MlyⅠ酶切后OligoMix 纯化
• 2.3.2 OligoMix 同源杂合退火
• 2.3.3 同源杂合片段连接
• 2.4 组装后片段PCR 扩增
• 2.5 连接与转化
• 2.5.1 连接反应
• 2.5.2 连接产物转化步骤
• 2.5.3 质粒提取
• 3 结果
• 3.1 OligoMix 丰度富集及纯化
• 3.2 纯化产物Mly I 限制性酶切鉴定
• 3.3 MlyⅠ酶切后OligoMix 组装
• 3.4 组装后片段PCR 扩增
• 3.5 质粒提取检测
• 4 讨论
• 第四章 Riboswitch 相关文库构建
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 质粒稀释，PCR
• 2.2 PCR 产物纯化
• 2.3 纯化产物PCR 扩增，电泳检测
• 2.4 DNA 模板体外转录Riboswitch
• 2.4.1 BbsⅠ限制性酶切3’末端引物序列
• 2.4.2 体外转录
• 3 结果
• 3.1 质粒PCR
• 3.2 目的片段回收
• 3.3 目的片段回收后PCR，纯化，含量检测及测定
• 3.4 Bbs I 限制性酶切3’末端侧翼引物，纯化产物
• 3.5 体外转录Riboswitch 及浓度测定
• 3.6 二级结构折叠预测与适体保守性分析
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢