南方根结线虫部分FLP神经肽受体基因的克隆和初步功能分析

论文摘要

神经肽受体（neuropeptide receptor, npr）是G蛋白偶联受体（GPCRs）中的一类,能接收多种神经肽信号并传达到胞内,其中包括FLPs （FMRFamide-like peptides）。本实验主要研究两个南方根结线虫（Meloidogyne incognita Chitwood）神经肽受体基因：M.i-npr-1和M.i-npr-3基因（简称npr-1/3）,主要工作如下：1.根据生物信息学预测靶标基因的序列,结合RACE法从南方根结线虫体内克隆了两个目的基因cDNA全长序列。npr-1基因开放阅读框全长1254bp,GenBank登录号为FJ456886。npr-3基因开放阅读框全长1035bp,GenBank登录号为GQ497771。生物信息分析表明,两个目的基因都具有7个跨膜结构,这是G蛋白偶联受体的典型特征。2.对npr-1和npr-3基因尝试了原核表达和真核表达,将目的基因成功地克隆到表达载体pET-30a和pPIC9K多克隆区域上。在原核和真核的诱导表达中,SDS-PAGE电泳均没有检测到目的条带。3.以南方根结线虫卵、二龄幼虫、成虫为材料,对npr-1和npr-3在不同虫态中的表达进行了分析。结果显示,两个基因在南方根结线虫卵、二龄幼虫、成虫中都有表达,说明两个目的基因在可能南方根结线虫的生活史中起重要作用。4.体外合成npr-1基因的两段dsRNA,利用浸泡法处理南方根结线虫的2龄幼虫然后侵染番茄,进行离体干扰效应验证。实验发现番茄根部的根结数量与对照相比明显下降。实时荧光定量PCR分析表明靶标mRNA表达量明显降低。上述研究结果表明npr-1基因在线虫的发育与寄生中具有关键作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 南方根结线虫及其危害
• 1.1 南方根结线虫的分类地位
• 1.2 南方根结线虫的危害及防治
• 2 线虫类FMRF酰胺肽及其G蛋白偶联受体的研究进展
• 2.1 FMRF酰胺肽
• 2.2 线虫FLP的GPCR
• 2.3 线虫FLP-GPCR在药剂研发方面的作用
• 3 植物抗线虫基因工程研究进展
• 3.1 抗线虫基因介导的植物抗线虫基因工程
• 3.2 外源蛋白
• 3.3 植物寄生线虫RNAi研究进展
• 4 科学问题的提出
• 第二章 M.I-NPR-1和M.I-NPR-3基因克隆及生物信息学分析
• 1 试验方法
• 1.1 植物材料培养
• 1.2 南方根结线虫接种
• 1.3 南方根结线虫二龄幼虫的收集
• 1.4 南方根结线虫总RNA的提取
• 1.5 cDNA的合成
• 1.6 npr-1和npr-3基因片段的克隆
• 1.7 RACE法扩增npr-3 3’端序列
• 1.8 PCR扩增npr-3基因完全开放阅读框序列
• 1.9 npr-1和npr-3基因内含子的扩增
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA的提取
• 2.2 npr-1及npr-3基因的扩增
• 2.3 RACE结果与分析
• 2.4 npr-3开放阅读框（ORF）序列的扩增
• 2.5 南方根结线虫npr-1和npr-3基因的编码区序列
• 2.6 目的基因内含子的扩增结果与分析
• 2.7 npr-1和npr-3基因编码的蛋白的结构分析
• 3 讨论
• 第三章 NPR-1和NPR-3基因的异源表达
• 1 试验材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 主要试剂、载体
• 1.3 溶液配制
• 1.4 培养基
• 2 试验方法
• 2.1 南方根结线虫各虫态的收集
• 2.2 npr-1和npr-3基因的原核表达
• 2.3 npr-1和npr-3基因的真核表达
• 2.4 目的基因在南方根结线虫不同虫态中的表达分析
• 3 结果与分析
• 3.1 npr-1和npr-3基因的原核表达结果分析
• 3.2 npr-1和npr-3基因的真核表达结果分析
• 3.3 npr-1和npr-3基因不同虫态的表达情况
• 4 讨论
• 第四章 南方根结线虫NPR-1基因的RNAI效应分析
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 主要仪器和试剂
• 1.3 npr-1基因dsRNA的合成
• 1.4 南方根结线虫的RNAi实验
• 2 结果与分析
• 2.1 dsRNA的合成
• 2.2 干扰效应的验证
• 3 讨论
• 第五章 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介