绵羊IGFBP家族基因克隆和IGF系统基因的时空表达谱及IGF-Ⅰ与体重性状的相关分析研究

论文摘要

IGFs介导生长激素（GH）促进动物生长的功能,在动物的胚胎及生后的生长发育过程中具有重要的作用,调节糖类代谢、脂肪代谢、蛋白合成、肝脏功能、线性生长等。IGFBPs在体内循环系统中与IGFs结合,调控IGFs的半衰期,提高IGFs的生理活性。肝脏和局部组织分泌的IGFs共同调控各个组织的生长与发育,从而促进动物机体的生长。本研究应用RT-PCR和克隆技术从绵羊肝脏组织总RNA中克隆出绵羊IGFBPs家族中的IGFBP-1、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5、IGFBP-6和IGFBP-7等6个基因的mRNA序列。序列分析表明6个基因的开放阅读框（ORE）全长分别为792bp、882bp、777bp、816bp、711bp和849bp,分别编码263、293、258、271、236和282个氨基酸;6个基因的碱基组成中G+C含量在60.23～68.34%之间,高于A+T;家族基因间的CDS序列的同源性在0.334～0.548之间,氨基酸同源性在0.124～0.426之间。进化分析表明IGFBPs家族基因分为1GFBP-1、IGFBP-3、IGFBP-6和1GFBP-7等4个进化支,在IGFBP-1进化支分化出IGFBP-2和IGFBP-4基因,在1GFBP-3进化支分化出IGFBP-5基因,而IGFBP-6和IGFBP-7进化支未分化出基因;结构及功能预测表明6个基因的氨基酸序列具有N-端和C-端保守区域以及中央的高变区域,在N-端分享了5-6个域内二硫键,在C-端分享了3个域内二硫键（IGFBP-7仅1个二硫键）;在N-端的前30AA内都含有一个信号肽区域,整个序列中具有明显的疏水性区域（IGFBP-7亲水性区域较多）,在IGFBP-1和IGFBP-7中分别具有1个和2个跨膜区,翻译后修饰主要为磷酸化和糖基化,二级结构以无规卷曲为主,其次为α-螺旋,β-折叠最少,6个基因的N-端具有一个IGFBPN功能域,而在C-端存在一个甲状腺球蛋白-1域（IGFBP-7为Ig-like域）。同时,还具有较多的豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点等。采用QRT-PCR技术研究了绵羊IGF系统基因在生长期的时空表达,结果表明:在各个时间点的各个组织中都检测到IGF系统基因的表达,但相对表达量存在一定的差异,IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ主要产生于肝脏组织,肝脏组织的表达高于大脑、心脏、皮肤和肌肉等组织,IGF-ⅠR、IGF-ⅡR和IGFBPs跟生后绵羊机体局部组织的具体功能而表现出较大的差异。IGF系统的大部分基因在各个时间点的表达呈现相似的表达规律,在大脑组织,11个基因在6个时间点的表达规律一致,呈波浪型变化,在15d、105d、195d时各个基因的表达相对较高,可能是应答于外界的营养条件而表现出较高的峰值,在60d、150d、240d时的表达相对较低,IGF-ⅠR在240d时表达较高,在195d→240d时IGF-ⅠR起了主要的作用;在皮肤组织,IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-2R、IGFBP-1、1GFBP-4、IGFBP-6和IGFBP-7基因的表达规律一致,在15d和60d时的表达相对较高,IGFBP-1和IGFBP-3基因在整个过程中逐渐降低,对皮肤的作用较弱,IGF-ⅠR基因在105d时的表达最低,而后其作用逐渐增强,IGFBP-5基因在60d时的表达相对较高,其他几个时间点上的表达保持稳定;在肌肉组织,IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF-2R、IGFBP-2和IGFBP-6基因的表达规律一致,在150d时的表达相对较高,IGFBP-1和IGFBP-7基因与前6个基因的表达相反,在肌肉中的作用是抑制了肌细胞的增殖与分化,IGFBP-3、IGFBP-4和IGFBP-5基因的表达较平衡,在肌肉中的作用较稳定;在肝脏组织,各个基因的表达规律倾向一致,在105d时除IGFBP-2和IGFBP-4基因在150d时的表达相对较高外其他基因在105d时的表达相对较高,在195d后,两个受体基因的表达比较稳定;在心脏组织中,除IGF-ⅠR基因外,其他10个基因的表达规律一致,在105d时的表达相对较高,150d后各个基因的表达倾向稳定。11个基因在肝脏和大脑等组织的表达表现为不同程度的正相关,心脏组织中IGF-ⅠR的表达除与IGF-ⅡR、IGFBP-1基因呈正相关外,与其他9个基因呈不同程度的负相关,其他基因则与皮肤组织、肝脏和大脑组织的表达相关性一致,肌肉中IGFBP-1基因与1GFBP-3、IGFBP-4和IGFBP-5基因间呈不同程度负相关,IGF-Ⅰ基因与IGFBP-7基因间呈显著的负相关,与其他基因或其他基因间呈不同程度正相关;皮肤组织中IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ基因与其他基因的相关性趋向一致,IGF-ⅠR与其他所有基因都呈负相关,7种蛋白基因之间呈不同程度的正负相关。采用SSCP技术研究IGF-Ⅰ基因的外显子前导区和外显子3的SNP位点,结果表明:P-1和P-2引物扩增的序列中是C→G和A→G突变,以A、C和AA、CC为优势等位基因与优势等位基因型;P-1的PIC含量在群体和各个家系中分别为0.276、0.252～0.303,为中度多态性,P-2分别为0.237、0.171～0.279,为中低度多态性;P-1的SNP位点与凉山半细毛羊的初生体重呈在显著的相关,P-2的SNP位点与断奶体重和断奶日增重存在极显著相关:单倍型以H2和H3占主导地位,组合型的H1H1、H1H3和H2H2的初生体重极显著高于其他几种组合型,H2H2组合型的断奶体重和断奶日增重极显著高于其他几种组合型,这两个SNP位点可用于凉山半细毛羊的早期生长性状的SNP辅助选择育种。

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Abstracts

第一章绪论

1.1 研究的背景

1.2 目的与意义

第二章文献综述

2.1 凉山半细毛羊资源群体

2.1.1 生态条件

2.1.2 凉山半细毛羊的来源

2.1.3 凉山半细毛羊的特性

2.1.4 细胞与生化水平

2.1.5 分子水平研究

2.1.6 遗传参数

2.2 生长介素假说

2.2.1 生长介素假说原型

2.2.2 生长介素假说的修正

2.3 IGFs分子结构及功能

2.3.1 IGFs分子结构

2.3.2 IGFs的生物学功能

2.4 IGFBPs的结构与功能

2.4.1 IGFBPs的结构

2.4.2 IGFBPs的功能

2.5 IGFBPs与IGFs的结合方式

2.5.1 结合IGFBPs的IGFs残基

2.5.2 结合IGFs的IGFBPs残基

2.5.3 IGFBPs的自然修饰影响IGF的结合

2.6 IGFBPs信号通路

2.6.1 整联蛋白信号通路

2.6.2 细胞凋亡信号通路

2.6.3 核信号通路

2.6.4 Smad信号通路

2.6.5 IGFBP-3的其他信号通路效应

2.7 IGF-ⅠR和IGF-ⅡR的研究进展

2.7.1 分子结构

2.7.2 主要的功能

第三章 IGFBP家族六个基因的克隆及生物信息学分析

3.1 材料与方法

3.1.1 试验材料

3.1.2 仪器与试剂

3.1.3 实验方法

3.2 结果与分析

3.2.1 总RNA提取

3.2.2 RT-PCR结果

3.2.3 序列分析

3.2.4 IGFBP家族的NJ系统发育树

3.2.5 蛋白质的理化特征

3.2.6 IGFBPs的同源性

3.2.7 蛋白质特性预测

3.3 讨论

3.3.1 蛋白翻译后修饰

3.3.2 IGFBPs的同源性

3.3.3 IGFBPs的分子进化

3.3.4 IGFBPs结构与功能

3.4 小结

第四章 IGF系统家族基因的表达研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验动物

4.1.2 试验试剂与器材

4.1.3 试验方法

4.2 试验结果

4.2.1 RNA提取

4.2.2 荧光定量引物验证

4.2.3 IGF基因的标准曲线

4.2.4 基因RT-PCR结果

4.2.5 IGF系统基因的组织差异表达

4.2.6 IGF系统基因的发育性变化

4.2.7 IGF系统基因间的表达相关分析

4.3 讨论

4.3.1 Real time PCR

4.3.2 IGF系统基因的组织表达

4.3.3 IGF系统基因的发育性变化

4.3.4 IGF系统基因的相关性

4.4 小结

第五章 IGF-Ⅰ基因的SSCP分析

5.1 试验材料与方法

5.1.1 试验群体

5.1.2 主要仪器和试剂

5.1.3 试验方法

5.2 试验结果

5.2.1 DNA提取结果

5.2.2 PCR扩增结果及测序

5.2.3 基因频率及多态性

5.2.4 表型性状间的相关分析

5.2.5 方差分析

5.2.6 多重比较

5.2.7 单倍型分析

5.2.8 遗传结构

5.3 讨论

5.3.1 PCR-SSCP的影响因素

5.3.2 IGF-Ⅰ基因遗传分布与变异

5.3.3 IGF-Ⅰ基因的生长效应

5.3.4 SNP位点与凉山半细毛羊的选育

5.4 小结

第六章结论

参考文献

附图克隆测序

攻读博士期间发表的论文

致谢

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