论文摘要
【研究背景】卵巢癌发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第三位,5年生存率在30%左右。由于卵巢癌发病隐蔽,易于转移和广泛播散,患者以腹水或盆腔包块就诊时已届临床晚期。以肿瘤细胞减灭术加术后铂类为主的联合化疗虽然明显的提高了卵巢癌的治疗效果,但有研究表明术后化疗即使能够获得临床完全缓解,仍有85%—90%的患者因癌细胞对化疗药物出现耐药性最终复发。研究发现细胞凋亡与恶性肿瘤的发生、发展及治疗密切相关,有关肿瘤细胞凋亡的研究对于阐明肿瘤的发病机制及提供新的治疗分子靶点具有重要的意义。Survivin基因是1997年由美国耶鲁大学Ambrosini等发现的凋亡蛋白抑制蛋白（Inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族中的一个新成员,是迄今发现的分子量最小也是抗凋亡作用最强的凋亡抑制因子,在调控细胞周期和抑制细胞凋亡中起重要作用。Survivin特异地表达于人和鼠的胚胎发育组织以及多数人类肿瘤细胞,在正常成人组织中不表达。国内外研究证实,survivin基因参与肿瘤的发生、发展,与肿瘤转移,化疗耐药及预后有关。针对survivin研究,将是揭示肿瘤分子病因学,探索肿瘤诊断与治疗新途径的一个理想的切入点。水飞蓟素（silymarin,SM）是从菊科植物水飞蓟中提取的黄酮类化合物,商品名为益肝灵、水林佳等。其中水飞蓟宾（silibinin,SB）为其最主要的生物活性成分,临床上主要用于治疗急、慢性肝炎、肝硬化及肝损伤,实践证明水飞蓟宾对肝损害具有一定的治疗作用,并显示良好的耐受性及极低的副作用。近年来随着药理学实验方法的发展和完善,人们发现SM、SB具有抗肿瘤作用。报道显示水飞蓟宾对各种上皮来源的肿瘤如肺癌、前列腺癌、结肠癌、膀胱癌等均具有明显抑制作用,对皮肤癌的发生具有预防作用。目前SB已进入治疗前列腺癌的Ⅰ期临床试验。大量体外及动物实验研究证实水飞蓟宾是通过抑制survivin等多种凋亡抑制基因,诱导肿瘤细胞凋亡来发挥其抗肿瘤活性的。研究发现水飞蓟宾与化疗药物如阿霉素联用可产生协同作用,是一种很有潜力的抗肿瘤药物。然而目前,有关水飞蓟宾对于卵巢癌细胞紫杉醇敏感性及侵袭转移能力的效果尚不清楚。本研究拟探讨水飞蓟宾对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性和侵袭能力的影响。实验分为三个部分:第一部分探讨survivin在卵巢癌组织中的表达及其临床意义;第二部探讨水飞蓟宾对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响和作用机制;第三部分探讨水飞蓟宾对卵巢癌细胞侵袭能力的影响和作用机制。旨在为水飞蓟宾的临床应用提供理论依据,为卵巢癌的治疗提供新的思路。第一部分Survivin在卵巢癌组织中的表达及其临床意义【目的】检测survivin在卵巢癌组织中的表达,并探讨其临床意义。【方法】应用实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction,QRT-PCR）及免疫组织化学技术（immunohistochemistry）分别检测65例上皮性卵巢癌（Epithelial ovarian cancer,EOC）组织中survivin mRNA和蛋白的表达,以11例正常卵巢组织作为对照。【结果】1、Survivin mRNA在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的表达:Survivin mRNA在正常卵巢组织中不表达,在卵巢癌组织中的表达率为83%（54/65）。在survivin基因阳性表达的卵巢癌组织中,survivin mRNA的表达水平与卵巢癌患者的临床分期,组织学分级及淋巴结转移有关（P＜0.05）,与组织学类型无关（P＞0.05）。2、Survivin蛋白在正常卵巢组织和卵巢癌组织中的表达:Survivin蛋白在正常卵巢组织中不表达,在卵巢癌组织中的表达率为78%（51/65）。Survivin蛋白免疫定位有三种形式:细胞核表达,细胞浆表达或核质共表达。在survivin蛋白表达阳性的卵巢癌组织中,survivin的亚细胞定位与卵巢癌患者的临床分期,组织学分级,组织学类型及淋巴结转移无关（P＞0.05）。【结论】1、Survivin mRNA的表达水平与卵巢癌患者的临床分期,组织学分级及淋巴结转移有关。2、Survivin的亚细胞定位与卵巢癌患者的临床分期,组织学分级,淋巴结转移,组织学类型无关。3、Survivin mRNA的表达水平与卵巢癌患者病情进展有关。第二部分水飞蓟宾对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性影响的实验研究【目的】探讨水飞蓟宾对卵巢癌细胞A2780及A2780/taxol紫杉醇敏感性的影响及其作用机制。【方法】1、采用四甲基偶氮唑盐（4,5-dimethyl thiazole or 2,5-diphenyl tetrazoliumbromide,MTT）法,检测不同浓度水飞蓟宾、紫杉醇单独或联合使用对A2780及A2780/taxol细胞的生长抑制率。2、流式细胞仪检测水飞蓟宾、紫杉醇单独或联合使用对A2780及A2780/taxol细胞凋亡率及细胞周期分布的影响。3、实时定量PCR及Western blot检测水飞蓟宾、紫杉醇单独或联合使用对A2780及A2780/taxol细胞中相关基因和蛋白表达的影响。【结果】1、水飞蓟宾对A2780及A2780/taxol细胞的生长抑制作用:浓度为50、75、100、125、150μmol/L水飞蓟宾作用72h对A2780细胞及A2780/taxol细胞的生长抑制率分别为13.21%、25.35%、39.16%、42.72%、44.12%及12.13%、28.47%、40.63%、43.41%、45.38%。水飞蓟宾可抑制卵巢癌细胞A2780、A2780/taxol的生长。2、水飞蓟宾和紫杉醇联合作用对A2780及A2780/taxol细胞的生长抑制作用:100nmol/L紫杉醇作用72h对A2780的生长抑制率为46.64%,浓度为50、100、150μmol/L水飞蓟宾作用72h对A2780的生长抑制率为13.51%、39.22%、44.18%,100nmol/L紫杉醇联合浓度分别为50、100、150μmol/L水飞蓟宾作用72h,对A2780细胞的生长抑制率分别为53.52%、62.34%、63.47%。水飞蓟宾与紫杉醇联合使用对A2780细胞的生长抑制作用明显高于紫杉醇或水飞蓟宾单独使用（P＜0.001-0.01）。1000nmol/L紫杉醇作用72h对A2780/taxol的生长抑制率为56.23%,浓度为50、100、150μmol/L水飞蓟宾作用72h对A2780/taxol的生长抑制率为12.45%、40.58%、45.71%,1000nmol/L紫杉醇联合浓度分别50、100、150μmol/L水飞蓟宾作用72h,对A2780/taxol细胞的生长抑制率分别为62.16%、71.69%、82.82%。水飞蓟宾与紫杉醇联合使用A2780/taxol细胞的生长抑制作用明显高于紫杉醇或水飞蓟宾单独使用（P＜0.001-P＜0.05）。3、水飞蓟宾对A2780、A2780/taxol细胞紫杉醇敏感性的影响:0、50、75、100、125、150μmol/L水飞蓟宾联合紫杉醇作用于A2780及A2780/taxol细胞72h后,紫杉醇IC50分别为138.15、96.23、80.61、59.19、58.32、57.18及699.06、498.68、354.42、200.89、110.15、64.33（nmol/L）。水飞蓟宾降低A2780、A2780/taxol细胞紫杉醇IC50,具有浓度依赖性。4、水飞蓟宾和紫杉醇联合作用对A2780及A2780/taxol细胞凋亡和细胞周期的影响:流式细胞分析结果显示水飞蓟宾（150μmol/L）、紫杉醇（100nmol/L）单独或联合作用于A2780及A2780/taxol细胞的凋亡率分别为12.23%、14.12%、39.37%及5.56%、11.82%、23.41%。水飞蓟宾与紫杉醇联合使用对A2780、A2780/taxol细胞的凋亡作用明显高于紫杉醇或水飞蓟宾单独使用（P＜0.001）。细胞周期分析结果显示A2780/taxol细胞对紫杉醇诱导的G2/M期阻滞有一定程度的耐受,水飞蓟宾联合紫杉醇作用与A2780/taxol 48h后,G2/M期细胞比率增加,G0/G1期细胞比率降低。5、水飞蓟宾联合紫杉醇对A2780及A2780/taxol细胞内耐药及凋亡相关基因和蛋白表达的影响:水飞蓟宾联合紫杉醇作用与A2780及A2780/taxol细胞72h后,A2780及A2780/taxol细胞内survinin表达明显降低,caspase-3的活化片段表达明显升高,A2780/taxol细胞内MDR-1、P-gp表达明显降低。Bcl-2在作用先后表达无明显变化。【结论】1、水飞蓟宾可抑制对卵巢癌细胞的生长。2、水飞蓟宾与紫杉醇联合使用对卵巢癌细胞的生长抑制作用明显高于紫杉醇或水飞蓟宾单独使用。3、水飞蓟宾增强卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性。4、水飞蓟宾增强卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的机制与降调survivin,P-gp,MDR-1表达有关。第三部分水飞蓟宾对卵巢癌细胞侵袭力影响的实验研究【目的】探讨水飞蓟宾对卵巢癌细胞A2780及A2780/taxol侵袭力的影响及其作用机制。【方法】1、采用四甲基偶氮唑盐（4,5-dimethyl thiazole or 2,5-diphenyl tetrazoliumbromide,MTT）法,检测水飞蓟宾作用24h对A2780及A2780/taxol细胞的生长抑制作用。2、Transwell体外侵袭实验分析水飞蓟宾作用24h对A2780及A2780/taxol细胞侵袭力的影响。3、实时定量PCR及Western blot检测水飞蓟素对A2780及A2780/taxol细胞中MMP-2、MMP-9、P-gp,MDR-1表达的影响。【结果】1、A2780/taxol与A2780细胞的侵袭能力的比较:Transwell分析结果显示A2780/taxol侵袭能力是A2780细胞的2.12倍。2、水飞蓟宾对A2780及A2780/taxol细胞的生长抑制作用:50、75、100μmol/L水飞蓟宾作用24h对A2780、A2780/taxol细胞无明显细胞毒性作用。3、水飞蓟宾对A2780及A2780/taxol细胞侵袭力的影响:50、75、100μmol/L水飞蓟宾作用24h对A2780、A2780/taxol的侵袭力的抑制率分别为18.24%、36.72%、53.66%及20.99%、39.45%、56.50%。水飞蓟宾对A2780、A2780/taxol的侵袭力有抑制作用,具有浓度依赖性。4、水飞蓟宾对A2780及A2780/taxol细胞内MMP-2、MMP-9、MDR-1、P-gp表达的影响:水飞蓟宾作用24h后,A2780及A2780/taxol细胞内MMP-2、MMP-9的表达明显降低,具有浓度依赖性。A2780/taxol细胞内MDR-1、P-gp表达明显降低,具有浓度依赖性。【结论】1、人卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/taxol的侵袭能力较非耐药卵巢癌细胞A2780明显增强。2、水飞蓟宾可通过降调MMP-2、MMP-9及MDR-1、P-gp表达抑制卵巢癌细胞的侵袭能力。
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