甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009株反向遗传操作系统的建立

论文摘要

A型流感病毒在温血动物中广泛存在,也是目前导致人类和各种动物流感疾病的主型。在自然情况下流感病毒感染的宿主范围有一定的特异性,分离自人的流感病毒一般不能在鸡、鸭等禽类体内复制,同样禽流感病毒在灵长类动物体内的复制能力也极差。但近年来不断发生禽流感病毒（包括H5N1,H9N2,H7N7亚型病毒）直接传染给人的事件。研究证实,流感病毒的致病性及跨种间传播的深层原因是病毒分子结构差异及其与宿主细胞相互作用。病毒多种结构蛋白和非结构蛋白某些功能位点上氨基酸的差异是病毒致病性及其跨种传播的分子生物学基础。2009年4月初,在墨西哥和美国边境发生了流感疫情,此次疫情通过人与人传播,几周后传播到了全球30多个国家,世界卫生组织（WHO）不断提升全球流感疫情警戒等级,将其升至最高级（6级）。通过对病原的分离鉴定,WHO宣布这场21世纪的第一次流感大流行是由一种新型猪源H1N1亚型流感病毒（novel swine-origin influenza virus A H1N1）引起。这种新型的流感病毒的遗传背景十分复杂,是一种多元重组病毒,其血凝素（HA）基因源于1918年猪流感病毒,其它基因源于人、禽和欧洲猪流感病毒。此前虽然也发生过多起猪流感感染人事件,但传播范围及其局限,此次的猪流感病毒为何能够跨越种间屏障,在人与人之间形成了有效传播成为人们关注的焦点。为了了解此次流感的传播机制,本研究选取了甲型H1N1流感病毒A/Sichuan/01/2009（SC/01）株为亲本毒株,构建了SC/01的8质粒反向遗传操作系统,并获得了甲型H1N1流感病毒救获株Rescue-A/Sichuan/01/2009（R-SC/01）。对救获毒株R-SC/01进行全基因序列测定,证明救获毒株与亲本毒株核苷酸序列完全一致。R-SC/01的小鼠半数感染量及受体结合特性与亲本野毒SC/01相一致。SC/01反向遗传操作系统的成功建立为进一步开展甲型H1N1流感病毒的生物学特性研究,特别是跨宿主传播机制研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略语表
• 第一章 流感病毒及其反向遗传操作技术的研究进展
• 1.1 流感病毒致病性的分子基础
• 1.1.1 血凝素蛋白（HA）与其致病性的关系
• 1.1.2 NA 蛋白与流感病毒致病性的关系
• 1.1.3 核蛋白与流感病毒致病性的关系
• 1.1.4 基质蛋白与流感病毒致病性的关系
• 1.1.5 NS 蛋白对流感病毒致病性的关系
• 1.1.6 聚合酶复合体与流感病毒的致病性关系
• 1.2 H1N1 流感病毒的病原学
• 1.3 H1N1 流感病毒的产生
• 1.4 H1N1 流感病毒的传播
• 1.5 反向遗传操作技术的发展
• 1.5.1 引言
• 1.5.2 反向遗传学发展的历程
• 1.5.3 感染性克隆的构建
• 1.5.4 核糖核蛋白（RNP）转染法
• 1.5.5 流感病毒12 质粒和17 质粒系统的建立
• 1.5.6 流感病毒8 质粒系统的建立
• 1.5.7 流感病毒4 质粒和1 质粒系统的建立
• 1.6 流感病毒研究中反向遗传操作技术的应用
• 1.6.1 流感病毒基因结构及蛋白功能的研究
• 1.6.2 流感病毒受体结合特性及传播机制的研究
• 1.7 结语
• 第二章 甲型 H1N1 流感病毒 A/Sichuan/01/2009 株反向遗 传操作系统的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 毒株、鸡胚及实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 2.1.4 RNA 的提取、反转录及病毒基因的扩增
• 2.1.5 重组质粒的构建
• 2.1.6 病毒的拯救
• 2.2 结果
• 2.2.1 救获病毒序列鉴定
• 2.2.2 救获病毒遗传稳定性鉴定
• 2.2.3 小鼠半数感染量（MLD50）的测定
• 2.2.4 病毒的滴定
• 2.2.5 小鼠的感染实验
• 2.3 结论
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介