鹿眼蛱蝶浓核病毒（JcDNV）感染机理和转录分析

论文摘要

鹿眼蛱蝶浓核病毒（Junonia coenia, JcDNV）属于细小病毒科浓核病毒属,1972年发现于蛱蝶科昆虫体内。JcDNV是一种简单的,二十面体单链DNA病毒,基因组约6kb,无包膜,在宿主细胞核内进行复制,其感染早期会在宿主细胞核内形成致密的染色质区。由于其高度的致病性以及能够在害虫中高效的传染性,JcDNV被认为是一种非常好的生物防治材料。本文对JcDNV的感染机理和转录模式进行了研究,获得的主要研究结果如下：1, JcDNV病毒通过跨细胞作用穿过草地贪夜蛾幼虫的中肠上皮组织浓核病毒能够感染昆虫幼虫,并造成致死性的病理变化。目前,关于这些病毒的水平传播机理知之甚少。据报道,浓核病毒的传播主要通过昆虫摄入被污染的食物来实现。在病毒进入昆虫体内后,首先需要穿透昆虫天然免疫的第一道屏障围食膜,进而克服中肠上皮屏障（或在中肠组织中复制）到达潜在的靶标组织开始复制。在这个过程中,病毒与中肠组织的交互作用是病毒能否成功感染昆虫宿主的关键。在本研究中,我们选择鹿眼蛱蝶浓核病毒（Junonia coenia densovirus, JcDNV）和其鳞翅目宿主草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）作为一个交互作用的生物模型来研究浓核病毒穿过其天然宿主肠道屏障的机制。该章节我们主要从四个主要方面来研究了JcDNV病毒与中肠的交互作用：1)中肠细胞感染的动态分析；2)能够被JcDNV病毒感染的中肠细胞类型；3)JcDNV在中肠内的转运机制；4) JcDNV病毒对完整的中肠上皮组织所产生的生理性影响。我们运用多种实验方法同时开展了体内和体外实验,在分子水平和生理学水平上揭示了JcDNV主要通过胞吞作用（endocytosis）侵入中肠柱状上皮细胞,进而通过跨细胞作用（transcytosis）穿过中肠上皮组织。虽然我们排除了JcDNV病毒直接采用旁细胞途径（paracellular pathway）的可能,但是在病毒感染过程却导致了中肠上皮组织通透性的增加,从而使得部分JcDNV出现在了胞间隙。最后,我们利用本实验室制备的在衣壳蛋白基因中引入了四个关键氨基酸突变的JcDNV突变型病毒Jc-8m开展了进一步的验证性实验。结果显示,突变型病毒Jc-8m在中肠组织中的跨胞作用受到了抑制,但是病毒的内化作用却没有受到影响。2,以家蚕作为新的生物模型来进行JcDNV的病理学分析为了对使用浓核病毒作为杀虫剂来控制鳞翅目害虫的可行性以及该病毒可能侵染新型宿主的风险值进行评估,必须首先明确该病毒致病机理和宿主域等相关知识。在这个章节中,我们以家蚕作为新的生物模型,结合TEN、qPCR技术和Ussing Chamber系统,对JcDNV的病理学和组织趋向性进行了评估。我们发现JcDNV在家蚕中的组织趋向性与在草底贪夜蛾幼虫中的类似。同时,我们还发现了一些非常显著的差异：1),JcDNV能够在家蚕的马氏管和脂肪体中进行高度复制,却不感染草底贪夜蛾幼虫的这两个组织。2),JcDNV不能感染家蚕的中肠组织但是却对其造成了严重的病理性损伤。3),用Ussing Chamber系统模拟JcDNV体内感染的实验结果显示,大约为草底贪夜蛾幼虫中肠上皮组织内病毒粒子数量30倍左右的JcDNV病毒在家蚕的中肠上皮组织中被检测到。这些结果说明,JcDNV病毒在家蚕中有着比对草地贪夜蛾幼虫更强烈的致病性。3,JcDNV病毒基因组的转录分析在该章节中,我们采用Northern blot技术,分析了被JcDNV感染性克隆pBRJ转染的昆虫细胞Ld652和斜纹夜蛾（Spodoptera littoralis）幼虫中JcDNV的转录情况。我们在两者中均发现了三个不同的转录子：即1个未剪切的编码结构蛋白的2.5kb VP mRNA,以及两个NS mRNA,其中1个未剪切的2.5kb mRNA编码NS3蛋白,另外一个1.7kb mRNA是由2.5kb mRNA经过剪切掉中间编码NS3的基因序列后的产物,其编码NS1及NS2蛋白。体内VP mRNA的翻译实验表明其生成的4个衣壳蛋白是通过核糖体遗漏扫描机制（a Ribosomal Leaky Scanning Mechanism）完成的。Northern blot以及RT-qPCR关于JcDNV nsl,ns3,vp基因转录的动态分析发现,在用pBRJ转染的Ld652细胞中,nsl, ns3, vp基因的转录起始时间分别为转染后的第2h,2h,3h,且在转染后的48h内均随着时间的推移而增加。其中,ns3转录子的数量增长的比较缓慢,且一直都低于nsl；vp基因的转录子数量在转染后前12h增长较为缓慢,12h-48h迅速增加。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 昆虫病毒概述及其分类
• 1.1.1 昆虫病毒概述
• 1.1.2 昆虫病毒的分类
• 1.2 浓核病毒
• 1.2.1 浓核病毒概述及其分类
• 1.2.2 浓核病毒的基因组结构
• 1.3 鹿眼蛱蝶浓核病毒JCDNV
• 1.3.1 JcDNV基因组结构特点及其研究进展
• 1.3.2 JcDNV及其它浓核病毒的转录及基因表达策略
• 1.3.3 JcDNV及其它浓核病毒侵染宿主的机制
• 1.3.4 JcDNV及其它浓核病毒的宿主范围及决定因子
• 1.3.5 JcDNV及其它浓核病毒病理学特征
• 1.3.6 JcDNV及其它浓核病毒在表达载体及生物防治中的应用
• 1.4 病毒侵入细胞的途径
• 1.4.1 注射式侵入
• 1.4.2 细胞内吞
• 1.4.3 膜融合
• 1.4.4 直接侵入
• 1.5 研究目的和意义
• 第二章 鹿眼蛱蝶浓核病毒早期感染机制的研究
• 2.0 实验材料
• 2.0.1 病毒、质粒、细胞和供试昆虫
• 2.0.2 主要试剂及仪器设备
• 2.0.3 主要缓冲液与相关试剂及其配置
• 2.0.3.0 JcDNV感染性克隆pBRJ质粒提取相关试剂的配置
• 2.0.3.1 病毒纯化相关溶液配置
• 2.0.3.2 Ussing Chambers System相关溶液的配置
• 2.0.3.3 免疫组化实验相关试剂配置
• 2.0.3.4 制备电镜超薄切片的相关溶液
• 2.0.3.5 草地贪夜蛾中肠细胞原代培养相关溶液及配置
• 2.0.3.6 其他试剂
• 2.1 实验方法
• 2.1.1 昆虫的饲养
• 2.1.2 提取JcDNV感染性克隆
• 2.1.3 JcDNV病毒qPCR标准曲线的绘制
• 2.1.4 JcDNV病毒的扩增及纯化
• 2.1.4.1 病毒的扩增
• 2.1.4.2 粗病毒液的制备
• 2.1.4.3 氯化铯密度梯度离心
• 2.1.4.4 透析
• 2.1.4.5 纯化后病毒粒子的电镜检测
• 2.1.5 病毒粒子拷贝数的qPCR测定
• 2.1.6 JcDNV对草地贪夜蛾幼虫中肠组织早期感染的分析
• 2.1.6.1 感染早期中肠样品的获得
• 2.1.6.2 中肠组织切片的制备
• 2.1.6.3 免疫荧光实验
• 2.1.7 草地贪夜蛾中肠干细胞的原代培养及感染
• 2.1.7.1 干细胞的分离培养
• 2.1.7.2 JcDNV对于分化细胞的感染及免疫荧光分析
• 2.1.8 利用Ussing Chammers系统对JcNDV穿透中肠上皮组织运输途径的研究
• 2.1.9 中肠组织电镜超薄切片的制备
• 2.1.10 JcDNV在几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织中穿透能力的比较
• 2.1.11 Jc-wt和Jc-8m对几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织通透性的影响
• 2.5 结果与分析
• 2.5.1 JcDNV病毒的qPCR标准曲线制备
• 2.5.2 JcDNV病毒粒子CsCl密度梯度离心纯化
• 2.5.3 JcDNV纯化病毒粒子的qPCR绝对定量测定
• 2.5.4 JcDNV感染草地贪夜蛾幼虫中肠上皮组织的早期特点
• 2.5.5 JcDNV侵染草地贪夜蛾中肠组织的靶细胞类型的研究
• 2.5.5.1 草地贪夜蛾中肠干细胞的体外分离培养
• 2.5.5.2 JcDNV感染中肠干细胞分化细胞的免疫组化分析
• 2.5.6 JcDNV穿透中肠上皮组织的运输机制研究
• 2.5.6.1 JcDNV病毒粒子能够迅速穿透中肠上皮组织
• 2.5.6.2 激光共聚焦显微镜检测JcDNV穿透中肠组织的细胞内动态分布情况
• 2.5.7 JcDNV的感染对中肠组织通透性的影响
• 2.5.8 JcDNV通过跨细胞作用穿透中肠组织
• 2.5.8.1 鞣酸Tannic acid能够抑制JcDNV穿透中肠上皮组织
• 2.5.8.2 JcDNV病毒的内化作用与小窝蛋白1和脂筏介导的胞吞作用有关
• 2.5.9 JcDNV在几种不同鳞翅目昆虫中肠上皮组织中穿透能力的比较
• 2.5.10 JcDNV衣壳蛋白上四个位点突变损伤了Jc-8m病毒粒子的跨细胞运输而非内化作用
• 2.5.11 Jc-wt和Jc-8m能够不同程度的提高昆虫中肠上皮组织的通透性
• 2.6 讨论
• 2.7 结论
• 第三章 以家蚕作为新的生物模型来进行JCDNV的病理学分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 病毒、细胞和供试昆虫
• 3.1.2 主要试剂及仪器设备
• 3.1.3 主要缓冲液与相关试剂及其配置
• 3.1.3.1 Ussing Chambers System相关溶液的配置
• 3.1.3.2 免疫组化实验相关试剂及其配置
• 3.1.3.3 组织切片及电镜超薄切片制备相关试剂
• 3.1.3.4 其他试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 昆虫的饲养
• 3.2.2 JcDNV病毒的制备及qPCR定量分析
• 3.2.3 草地贪夜蛾幼虫半数致死量LD50的测定
• 3.2.4 JcDNV感染家蚕幼虫
• 3.2.5 家蚕病理学分析
• 3.2.5.1 组织病理切片观察
• 3.2.5.2 免疫荧光分析
• 3.2.6 家蚕病变组织电镜超薄切片的制备
• 3.2.7 JcDNV穿过家蚕中肠组织时间及比例的比较分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 JcDNV LD50测试结果
• 3.3.2 JcDNV对家蚕幼虫的感染及免疫荧光分析
• 3.3.3 JcDNV感染家蚕后组织电镜检测
• 3.3.4 JcDNV感染家蚕对其中肠组织通透性的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 鹿眼蛱蝶浓核病毒JCDNV转录分析
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 质粒、菌株、细胞系等
• 4.1.2 试剂、溶液及实验设备
• 4.1.3 引物设计合成及探针制备
• 4.1.4 相关质粒的构建
• 4.1.5 昆虫细胞Ld652及昆虫幼虫的转染
• （1） 转染昆虫细胞Ld652
• （2） 转染斜纹夜蛾幼虫
• 4.1.6 Trizol法提取Ld652细胞及斜纹夜蛾幼虫的总RNA
• 4.1.7 RT-qPCR检测JcDNV ns1,ns3,Vp基因转录
• （1） cDNVA第一链的合成
• （2） qPCR扩增
• 4.1.8 Northern blot检测
• 4.1.9 SDS-PAGE和western blot分析
• 4.1.10 免疫荧光检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 NS和VP转录物的预测分析及鉴定策略
• 4.2.2 Northern blot检测
• 4.2.3 JcDNV VP mRNA翻译产物分析
• 4.2.4 Northern blot分析JcDNV ns, vp基因转录
• 4.2.5 RT-qPCR实时定量分析JcDNV NS1,NS3,VP基因转录的动态过程
• 4.3 讨论
• 4.4 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间论文发表情况
• 致谢