豆酱米曲霉α-淀粉酶的分离纯化与酶学性质分析

论文摘要

豆酱是我国传统的发酵豆制品,以其特有的风味和香气,几千年来深受人们的喜爱。随着科学技术的不断发展和人们生活质量的不断提高,制酱工艺也不断推陈出新。与传统生产工艺相比,采用纯酶制剂生产豆酱,能够提高产品质量,缩短发酵周期,成为当前豆酱制造业的发展趋势。本文以来源于豆酱的米曲霉（Aspergillus oryzae）HDF-10为出发菌株,对其所产的α-淀粉酶进行了分离纯化及酶学性质研究,为该酶应用于制酱工业奠定了基础。采用PEG/（NH4）2SO4双水相萃取法对α-淀粉酶进行初步分离纯化。研究了各单因素对α-淀粉酶在双水相体系中的分配系数Ka及回收率Yt的影响,通过正交试验确定了各单因素的最优组合为pH6.5,加入浓度为13%（w/w）NaCl溶液,PEG1500浓度为30%（w/w）,（NH4）2SO4浓度为9%（w/w）。经双水相体系萃取后的α-淀粉酶,其分配系数Ka为3.738,回收率Yt为85.315%。粗酶液经PEG1500/（NH4）2S04双水相萃取、Sephadex G-75凝胶层析分离纯化后,由SDS-PAGE电泳检验其纯度,凝胶染色后为单一条带,分子量为55kDa,纯化倍数为25.64倍,回收率为47.2%。部分氨基酸序列测序结果通过NCBI Protein BLAST比对后发现,与已有报导的Aspespillus spp.α-淀粉酶具有93%相似性,酶学性质亦有不同。因此,此酶可能为一种新酶。该α-淀粉酶最适反应pH为6.0,pH5.0-6.0范围内稳定;最适反应温度为60℃,50-60℃范围内稳定,相对酶活均维持在85%左右。Mn2+、Cu2+对酶活力有较强的抑制作用,K+、Ca2+有较强的促进作用。可溶性淀粉溶液纯酶水解产物的薄层层析结果表明,可溶性淀粉逐渐被水解为葡萄糖、麦芽糖及一些低聚糖,表明该α-淀粉酶为内切水解酶。综上所述,应用PEG/（NH4）2SO4双水相萃取法提取α-淀粉酶简化了纯化步骤,提高了酶回收率,保持了酶的高活性,同时在操作过程中降低了纯化试剂带来的毒害性,为其在酶法制酱及其它食品工业行业提供广阔的应用前景。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 α-淀粉酶简介
• 1.2 α-淀粉酶产生菌株
• 1.3 α-淀粉酶的分离纯化
• 1.3.1 α-淀粉酶分离纯化的传统方法
• 1.3.2 双水相萃取分离α-淀粉酶
• 1.4 米曲霉α-淀粉酶在豆酱生产中的应用
• 1.4.1 豆酱的生产现状
• 1.4.2 曲霉菌在豆酱生产中的作用
• 1.4.3 酶法制酱
• 1.5 本研究的目的与意义
• 1.5.1 研究的目的
• 1.5.2 研究的意义
• 1.6 本试验的技术路线
• 1.7 课题资助名称
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试菌种
• 2.1.2 主要培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 主要试剂及缓冲液配制
• 2.2 α-淀粉酶粗酶液的制备
• 2.2.1 菌种的活化
• 2.2.2 单孢子悬液的制备
• 2.2.3 种子液的培养
• 2.2.4 粗酶液的制备
• 2.2.5 菌种的保藏
• 2.3 分离纯化操作的试验预处理
• 2.3.1 Sephadex G-75的溶胀
• 2.3.2 透析袋的预处理
• 2.3.3 层析柱的清洗
• 2.3.4 层析柱的再生与保存
• 2.4 α-淀粉酶酶活力的测
• 2.4.1 可溶性淀粉梯度液的配制
• 2.4.2 标准曲线的绘制
• 2.4.3 酶活力的测定方法
• 2.5 蛋白质含量的测定
• 2.5.1 标准曲线的绘制
• 2.5.2 样品中蛋白质含量的测定
• 2.6 α-淀粉酶的分泌类型
• 2.7 培养时间及接种量对粗酶液中酶量的影响
• 2.8 α-淀粉酶的分离纯化
• 2.8.1 初步分离纯化方法的选择
• 2.8.2 Sephadex G-75凝胶层析
• 2.9 α-淀粉酶酶学性质的研究
• 2.9.1 酶反应的最适pH和酸稳定性
• 2.9.2 酶反应的最适温度和热稳定性
• 2.9.3 金属离子对酶活力的影响
• m及V_m的测定'>2.9.4 K_m及V_m的测定
• 2.9.5 淀粉水解产物分析
• 第3章 结果与分析
• 3.1 标准曲线的绘制
• 3.1.1 酶标准曲线的绘制
• 3.1.2 蛋白质标准曲线的绘制
• 3.2 α-淀粉酶分泌类型的判断
• 3.3 发酵培养时间及接种量对粗酶液中酶量的影响
• 3.4 α-淀粉酶的分离纯化
• 3.4.1 初步分离纯化方法的确立
• 3.4.2 Sephadex G-75凝胶层析分离纯化
• 3.4.3 氨基酸序列分析
• 3.5 α-淀粉酶的酶学性质分析
• 3.5.1 酶反应的最适pH和酸稳定性
• 3.5.2 酶反应的最适温度和热稳定性
• 3.5.3 金属离子对酶活力的影响
• m及V_m的测定'>3.5.4 K_m及V_m的测定
• 3.5.5 淀粉水解产物的薄层色谱结果分析
• 第4章 讨论
• 4.1 α-淀粉酶初步分离纯化方法的比较
• 4.2 α-淀粉酶部分氨基酸序列分析结果的功能性预测
• 4.3 不同来源和性质α-淀粉酶的应用领域
• 4.4 米曲霉（Aspergillus oryzae）α-淀粉酶在豆酱生产中的应用
• 4.5 工作展望
• 第5章 结论
• 参考文献
• 附录1
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文