吡啶衍生物的微生物羟基化及其酶的基因克隆与表达的研究

论文摘要

6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶是吡啶衍生物中重要的合成烟碱类杀虫剂的中间体,化学合成困难,而微生物转化的方法专一性强、条件温和且收率高,因此具有很好的应用前景。本论文以吡啶衍生物烟酸和3-氰基吡啶为底物,开展了Comamonas testosteroni JA1菌株微生物羟基化的研究,建立了烟酸和3-氰基吡啶双底物偶联生产新工艺,有效提高了吡啶衍生物的生产效率。同时,深入研究了两种不同来源的（C.testosteroni JA1菌株和Pseudomonas putida KT2440菌株）不同底物特异性（前者能羟基化烟酸和3-氰基吡啶,后者仅能羟基化烟酸）的吡啶衍生物羟基化的酶基因的克隆与功能表达,并探讨了该酶的基因结构与底物特异性功能之间的关系。JA1菌株是一株具有氰基吡啶羟基化酶活性的菌株,研究表明它还具有很高的烟酸羟基化酶的活性,是未报道过的具有烟酸羟基化酶活性的新菌种。该菌最适生长和产酶的碳源为1%葡萄糖、氮源为1%蛋白胨、诱导物为1%烟酸。此外,它的发酵条件优越,在温度25～37℃、初始pH6.5～7.0、装液量（100mL锥形瓶）10mL～40mL范围内产酶能力均保持很高水平,具有工业化生产应用的前景。研究了JA1菌株静息细胞转化烟酸生产6-羟基烟酸的最佳条件:pH为7.0、温度30℃、烟酸浓度3%。采用初步优化后的条件和流加底物的方式进行1.5 L和30L上罐生产,C.testosteroni JA1菌株的6-羟基烟酸产率分别为87.35 g/L和68.42g/L。底物特异性实验结果揭示了吡啶环6位引入羟基的规律,即吡啶环3位取代基团的电子效应（诱导效应和共扼效应）对吡啶环上6位羟基化反应起关键作用,-I和-C效应越大,反应越容易进行,该规律为其他吡啶衍生物的合成提供了思路。JA1菌株能羟基化3-氰基吡啶生产6-羟基-3-氰基吡啶,在发酵过程中需要添加诱导物烟酸。随后发现菌株又能羟基化烟酸,并且诱导培养阶段的6-羟基烟酸很少降解,遂开展了偶联生产这两种吡啶衍生物新工艺的研究。新的转化工艺应用于生产6-羟基-3-氰基吡啶,通过向发酵液中回补烟酸的方法利用该菌株的生长细胞转化烟酸,不仅多获得了50.38 g/L的第二个产物6-羟基烟酸（转化率99.97%）,同时,实验表明诱导培养阶段回补烟酸至22h,3-氰基吡啶羟基化酶的活性是不回补对照样品的2倍多,因此6-羟基-3-氰基吡啶的产量也提高到了5.77g/L,高于Yasuda et al（1995）报道的C.testosteroni MCI2848菌株静息细胞转化的6-羟基-3-氰基吡啶4.39g/L的产量。这种烟酸和3-氰基吡啶双催化的新生产工艺将有效利用诱导物,并获得两个目的产物,节约成本,大大提高生产效率。研究发现JA1菌株对多种抗生素具有抗性。碱变性法提取细胞内的质粒,检测到一个约19kb大小的质粒。用0.0025%SDS进行质粒消除实验,结果表明,质粒消除后菌株对卡那霉素敏感,但仍对氨苄青霉素、安普霉素和链霉素具有抗性,推测质粒携带卡那霉素的抗性基因。同时,质粒消除后,JA1菌株烟酸脱氢酶酶活性没有变化,推测烟酸脱氢酶的基因并不在质粒上。研究烟酸和6-羟基烟酸的紫外吸收光谱,建立了一种基于96孔板-酶标仪的双波长紫外分光光度法高通量筛选6-羟基烟酸转化菌的方法。6-羟基烟酸最大吸收波长为251nm,选251nm为测定波长,运用等吸收法进行比较,以确定消除6-羟基烟酸和烟酸的相互干扰,选231nm为参比波长。6-羟基烟酸与△A251～231在0.5～11μg/mL浓度范围内有良好的线性关系,服从朗伯-比尔定律,平均回收率为99.11%～100.81%。利用96孔板-酶标仪,每天筛选量可达到2000～5000个反应,达到高通量筛选要求。应用该方法筛选JA1菌株基因组文库,筛选了5000个转化子,未获得含烟酸脱氢酶基因的阳性克隆。Ashraf Alhaper 2006年发表文章首次公布了Eubcterium barkeri菌株及推测的其他9个菌种烟酸脱氢酶基因序列,而研究最早,应用最多的假单胞菌未列其中,且未见该基因克隆与表达的研究报道。本实验室先前报道了一株P.putida NA-1的可以转化烟酸,但该菌株的基因组序列没有公布。与NA-1相似,P.putidaKT2440菌株能羟基化烟酸,但不能羟基化3-氰基吡啶,而该菌株基因组序列已经公布。根据Eubcterium barkeri菌株和其他菌种推测的NaDH的功能域序列（FAD、[2Fe2S]、钼蛋白和细胞色素c）,在KT2440基因组上检索到很多相似性高的功能域序列,但仅有一个基因簇（命名为ndhSL,登陆号EU604833）编码的序列与报道中NaDH功能域排列顺序相同,推测为KT2440的NaDH蛋白,该蛋白与报道的三株好氧细菌NaDH之间的相似性为62～64.0%,与四株厌氧细菌NaDH之间的相似性为10～11.3%。进一步开展基因克隆与功能表达ndhSL基因簇,重组蛋白有烟酸脱氢酶活性,但不能羟基化3-氰基吡啶,基因敲除的结果进一步证明了ndhSL就是NaDHKT2440的编码基因,该研究是假单胞菌属来源的烟酸脱氢酶基因序列和功能表达的首次报道。根据NaDHKT2440在内的好氧菌NaDH保守序列,设计简并引物扩增JA1菌株NaDHJA1保守序列继而反向PCR的方法扩增全长编码基因ndhSLM基因簇（Gene bank EU418449）。该蛋白与好氧细菌NaDH之间的相似性为52.8～54.6%,与厌氧细菌NaDH之间的相似性为8.9～10.3%,与KT2440菌株的NaDH的相似性为52.8%。克隆表达的重组蛋白既能羟基化烟酸,又能羟基化3-氰基吡啶,证明了烟酸和3—氰基吡啶的羟基化均是由烟酸脱氢酶催化的。结合NCBI比对结果,分析NaDHKT2440和NaDHJA1功能域结构差异,蛋白亚基置换结果显示:置换前后含KT2440的NaDHS蛋白亚基的蛋白(NaDHKT2440和NaDHKTS+JALM)都不能羟基化3-氰基吡啶,而置换前后含JA1的NaDHS蛋白亚基的蛋白(NaDHJA1和NaDHJAS+KTL)都能羟基化3-氰基吡啶,说明了JA1菌株的NaDHS蛋白亚基决定了3-氰基吡啶羟基化功能。

论文目录

• 目录
• 缩写
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 一、烟碱类农药的发展
• 二、烟碱类农药合成中间体吡啶衍生物的研究
• 三、微生物转化烟酸合成吡啶衍生物的研究进展
• 四、微生物转化烟酸酶的研究进展
• 五.本课题的研究内容、思路及方法
• 1.研究内容
• 2.研究思路
• 3.研究中所涉及的主要研究方法概述
• 第二章 吡啶衍生物的微生物转化及偶联生产工艺的研究
• 第一节 C.testosteroni JA1菌株培养条件的优化研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌体培养方法
• 1.3 转化方法
• 1.4 产物检测方法
• 2.结果
• 2.1 JA1菌株的生长与产酶曲线
• 2.2 碳源对菌体生长和产酶的影响
• 2.3 氮源对菌体生长和产酶的影响
• 2.4 诱导物对菌体生长和产酶的影响
• 2.5 金属离子对菌体生长和产酶的影响
• 2.6 温度对菌体生长和产酶的影响
• 2.7 初始pH值对菌体生长和产酶的影响
• 2.8 溶解氧量对菌体生长和产酶的影响
• 3.讨论
• 第二节 C.testosteroni JA1菌株静息细胞羟基化烟酸的条件优化研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌体培养方法
• 1.3 转化方法
• 1.4 转化产物检测方法
• 2.结果
• 2.1 pH值对转化效率的影响
• 2.2 缓冲介质对转化效率的影响
• 2.3 度对转化效率的影响
• 2.4 底物浓度对转化效率的影响
• 2.5 菌量对转化效率的影响
• 2.6 转化底物特异性
• 2.7 6-羟基烟酸的生产性能评价
• 3.讨论
• 第三节 烟酸和3-氰基吡啶双底物微生物羟基化偶联生产工艺的研究
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌体发酵培养方法
• 1.3 菌体生长细胞的转化方法
• 1.4 菌体静息细胞转化方法
• 1.5 转化产物的测定
• 1.6 产物的分离与提纯
• 2.结果
• 2.1 发酵液转化的时间进程
• 2.2 起始烟酸浓度对发酵液中6-羟基烟酸积累的影响
• 2.3 回补烟酸对6-羟基烟酸在发酵液中积累的影响
• 2.4 回补烟酸对烟酸、3-氰基吡啶羟基化的影响
• 2.5 双催化工艺偶联生产6-羟基烟酸和6-羟基-3-氰基吡啶
• 3.讨论
• 第三章 吡啶衍生物羟基化酶基因的高通量筛选
• 第一节 C.testosteroni JA1抗性质粒消除的研究
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株来源
• 1.2 菌株的纯化与活化
• 1.3 抗生素抗性检测
• 1.4 质粒抽提及检测
• 1.5 质粒的消除
• 1.6 质粒消除后菌株生长特性的检测
• 2.结果
• 2.1 JA1菌株对抗生素的抗性
• 2.2 质粒消除剂浓度的确定
• 2.3 质粒消除率
• 2.4 质粒消除后菌株特性的变化
• 3.讨论
• 第二节 基于微孔板的高通量测定烟酸脱氢酶活性方法的建立
• 1.材料和方法
• 1.1 主要试剂与仪器
• 1.2 实验方法
• 2.结果
• 2.1 吸收光谱和A的选择
• 2.2 工作曲线
• 2.3 稳定性试验
• 2.4 菌体代谢物干扰实验
• 2.5 样品的测定
• 2.6 回收率的测定
• 2.7 6-羟基烟酸转化菌的高通量筛选实例
• 3.讨论
• 第三节 鸟枪法克隆C.testosteroni JA1烟酸脱氢酶基因的尝试
• 1.材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 主要仪器
• 1.3 培养基和试剂
• 1.4 菌体全基因组DNA的制备方法
• 1.5 DNA浓度及纯度测定方法
• 1.6 高拷贝质粒DNA的小量提取（碱变性法）
• 1.7 染色体DNA的部分酶切与酶切片段的回收
• 1.8 脱磷酸化载体pUC18的制备
• 1.9 电转化E.coli DH10B感受态细胞的制备方法
• 1.10 酶连及酶连产物的电击转化
• 1.11 本节技术路线
• 2.结果
• 2.1 C.testosteroni JA1全基因组DNA的获得
• 2.2 C.testosteroni JA1全基因组DNA浓度及纯度
• 2.3 总DNA的Sau3A Ⅰ不完全酶切
• 2.4 文库质量分析
• 2.5 阳性克隆的筛选
• 3.讨论
• 第四章 吡啶衍生物羟基化酶的克隆与表达
• 第一节 KT2440 ndhSL基因簇的克隆与表达
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌株培养与保藏
• 1.3 DNA操作
• 1.4 蛋白质分析及酶活测定
• 2.结果
• 2.1 KT2440烟酸脱氢酶活性
• 2.2 KT2440基因组上ndh基因克隆与分析
• 2.3 KT2440 ndhSL基因簇的表达与鉴定
• 2.4 KT2440 ndhSL基因簇的敲除
• 3.讨论
• 第二节 JA1 ndhSLM基因簇的克隆与表达
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌株培养与保藏
• 1.3 DNA操作
• 1.4 蛋白质分析及酶活测定
• 2.结果
• 2.1 JA1 ndh基因克隆与分析
• 2.2 JA1 ndhSLM基因簇的表达与鉴定
• 3.讨论
• 第三节 NaDH功能域与底物特异性关系的探讨
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 菌株培养与保藏
• 1.3 DNA操作
• 1.4 蛋白质分析及酶活测定
• 2.结果
• KT2440和NaDH_JA1功能域比对分析'>2.1 NaDH_KT2440和NaDH_JA1功能域比对分析
• KT2440和NaDH_JA1蛋白亚基置换实验'>2.2 NaDH_KT2440和NaDH_JA1蛋白亚基置换实验
• 3.讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1 二十种常见氨基酸
• 附录2 质粒物理图谱
• 附录3 博士在读期间主要科研情况