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口蹄疫免疫原基因在玉米中的转化

2020-12-06阅读(718)

口蹄疫免疫原基因在玉米中的转化

论文摘要

口蹄疫是当今世界危害最严重的家畜传染病,灭活疫苗接种是预防口蹄疫的主要措施。随着植物基因工程的发展,转基因植物表达抗原成为可能,相对传统疫苗植物是一种更安全、更经济的表达系统。本研究将口蹄疫病毒免疫原基因整合进二倍体玉米基因组,提取玉米叶片DNA,根据植株DNA的PCR检测,筛选阳性植株,为FMDV转基因可饲疫苗的开发奠定基础。由于植物生产外源蛋白技术已经成熟,使得利用植物生产口服疫苗成为可能,本研究从实际生产出发,选用玉米胚性愈伤组织为转化材料,构建了携带FMDV结构蛋白VP1基因及P12A-3C基因的植物表达载体并优化转化系统。具体结果如下:1)FMDV Asia1/HeBei株乳鼠毒,提取病毒总RNA,通过RT-PCR获得目的基因P12A和3C,将目的基因连接克隆载体,对结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C基因进行测序分析,P12A全长2247nt,编码749个氨基酸,3C全长639nt,编码213个氨基酸。同过引物设计PCR扩增引入酶切位点,构建pGEM-T-P12A-3C载体。再将P12A-3C片段从该质粒酶切下来,连接到pC1300-SOD载体上,构建植物表达载体pC1300-P12A-3C。测序结果证明载体成功构建并将其转化进入农杆菌,通过农杆菌介导法转化外源基因:2)根据玉米密码子偏好性优化FMDV O/HK/99毒株VP1序列、Asia 1型FMDVVP1序列、及大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位（LTB）和霍乱弧菌毒素B亚单位（CTB）,合成1095bp的Kozak-LTB-linker-Asia/VP1和1101bp的Kozak-CTB-linker-O/VP1基因。构建植物双价载体pC1300-LTB-Asia1/VP1-CTB-O/VP1。并通过基因枪导入法转化外源基因;3)优化玉米转化系统,以N6及MS为基本培养基,选用玉米“18白”愈伤组织材料,低温生长并继代四次,活化的根癌农杆菌介导及基因枪导入法转化外源基因,暗共培养3d后,再潮霉素梯度筛选,培养抗性愈伤并分化出苗。用多效唑及生根粉控制植株生长,选用株高2.5-3cm的植株在壮苗生长培养基中生长。受调节剂调控植株抗逆性提高,其成活率达到25%。植株大田生长良好,并收到第一代转基因玉米种子。4)免疫原基因VP1和P12A3C分别以不同的方法转入玉米愈伤组织,转基因玉米PCR检测表明,FMDV免疫原基因P12A-3C整合到玉米基因组中。

论文目录

  • 摘要
  • Summary
  • 英文缩略词
  • 第一章 引言
  • 1.1 口蹄疫及其疫苗
  • 1.1.1 口蹄疫概况
  • 1.1.2 口蹄疫病毒
  • 1.1.3 口蹄疫疫苗研究进展
  • 1.2 玉米及玉米转基因的研究
  • 1.3 植物转基因技术研究
  • 1.4 转基因植物疫苗存在问题及发展方向
  • 1.5 转基因植物的生物安全问题
  • 1.6 本研究的目的和意义
  • 第二章 口蹄疫病毒ASIA Ⅰ/HEBEI株目的基因P12A、3C的克隆及植物双元载体的构建
  • 2.1 材料与方法
  • 2.1.1 病毒与乳鼠
  • 2.1.2 载体及主要试剂
  • 2.1.3 病毒增殖
  • 2.1.4 病毒RNA提取
  • 2.1.5 P1-2A 3C基因（含两端非编码区）的克隆与鉴定
  • 2.1.6 pGEM-Teasy--3C、P1-2A（编码区）质粒载体的构建
  • 2.1.7 pGEM-Teasy-P12A-3C（编码区）质粒载体的构建
  • 2.1.8 pC1300-P12A-3C质粒载体的构建
  • 2.2 结果与分析
  • 2.2.1 P1-2A、3C基因的PCR扩增与鉴定
  • 2.2.2 质粒鉴定
  • 2.2.3 目的基因P12A-3C的序列测序与分析
  • 2.2.4 口蹄疫病毒P12A-3C基因植物表达载体的构建与分析
  • 2.3 讨论
  • 第三章 密码子优化的口蹄疫病毒ASIA1.O型VP1植物表达双价载体的构建
  • 3.1 材料和方法
  • 3.1.1 质粒和菌株
  • 3.1.2 引物和工具酶
  • 3.1.4 主要仪器
  • 3.1.5 基因改造与合成
  • 3.1.6 pC1300-HW056-HW055质粒载体的构建
  • 3.2 结果与分析
  • 3.2.1 植物表达载体pC1300-HW055-HW056的构建与鉴定
  • 3.3 讨论
  • 第四章 饲草玉米亲本胚性愈伤材料的组织培养及目的基因的转化
  • 4.1 材料和方法
  • 4.1.1 载体
  • 4.1.2 激素
  • 4.1.3 抗生素
  • 4.1.4 种子的准备和玉米田间管理
  • 4.1.5 玉米胚性愈伤的培养
  • 4.1.6 玉米愈伤组织的遗传转化
  • 4.1.7 转基因植株的PCR检测
  • 4.2 结果与分析
  • 4.2.1 玉米愈伤组织材料的选择及培养
  • 4.2.2 转基因植株的PCR检测
  • 4.2.3 潮霉素对愈伤组织的筛选试验结果
  • 4.2.4 矮壮素及生根粉在壮苗培养基中的使用对幼苗的影响
  • 4.3 讨论
  • 全文总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简介
  • 附录1: P12A基因序及核苷酸序列比对图
  • 附录2: 3C基因序及核苷酸序列比对图

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