陆地棉棉铃离层赤霉素、乙烯处理相关基因差减文库的构建

论文摘要

棉花是世界上的重要经济作物,棉纤维是纺织工业中天然纤维的主要来源,棉花还是重要的战略物质。随着纺织工业的迅猛发展,棉花的需求量逐年递增。目前,棉花的品种改良在很大的程度上改善了棉花的产量和品质,但是棉花蕾铃脱落的现象很普遍。研究激素与棉花蕾铃脱落的关系,从分子水平研究蕾铃脱落的机制,克隆在离层特异表达的基因,不仅可以深入认识棉花蕾铃脱落的分子机理,还可以为改良棉花产量的遗传工程奠定物质基础。为研究棉铃脱落的机制,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,通过构建抑制差减杂交（SSH）文库的方法,筛选出在离层表达的基因。取得的主要研究结果如下:1.采用赤霉素（gibberellin,GA3）和乙烯利（ethephon,CEPA）2种激素,分别设置3种浓度（GA3:10ppm、50ppm、100ppm;CEPA:10ppm、250ppm、1000ppm）处理,在TM-1开花当天点涂棉铃铃柄,7天后调查脱落率。赤霉素处理,在2006年,10ppm和50ppm与对照差异均显著,而100ppm处理与对照无显著差异:2007年,3种处理与对照差异均显著。乙烯利处理,在2006年,250ppm和1000ppm与对照差异均显著,而10ppm处理与对照无显著差异;2007年,3种处理与对照差异均显著。赤霉素各浓度处理效果在年份间差异很大,说明气候条件对赤霉素的作用有很大影响。2.50ppm赤霉素处理有显著的保铃效果,250ppm乙烯利处理能显著促进棉铃的脱落。我们以陆地棉遗传标准系TM-1为材料,构建了两个离层组织的抑制差减杂交（SSH）cDNA文库。来自于50ppm赤霉素和250ppm乙烯利处理开花当天的棉铃离层cDNA分别作为两个SSH文库的Tester,涂水对照开花当天的棉铃离层cDNA作为两个文库的Driver。反向Norethern杂交在两个文库中筛选克隆,测序了80个克隆,序列分析共产生28条单一序列。在分析的EST中,已知功能的序列包括翻译相关、信号转导、代谢相关、转录相关、能量代谢、蛋白合成和抗逆相关基因,其中有29%是与翻译相关的核糖体基因,这说明了在激素处理后,离层有大量的蛋白质合成。另外,与信号转导和代谢相关的基因占14%,与转录相关的基因占11%。3.为了分析离层优势表达基因的时空表达模式,我们从文库中挑选了10个基因进行了RT-PCR分析。查尔酮合酶基因（Chalcone synthase,CHS）在每个组织不同时期均有表达,但表达量有差异,在赤霉素处理2h后的离层中表达较高。缩氨酸异构酶基因（Cytosolic cyclophilin,ROC3）在根、茎中表达很强,在叶、离层各时期表达较弱,在赤霉素处理2h后的离层中不表达。肿瘤蛋白（Translationally controlled tumor protein,TCTP）在根、茎中表达很强,在叶中几乎不表达,在赤霉素处理0.5h后微弱表达,12h后表达达到最强。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 前言
• 1.2 蕾铃脱落的生物学规律
• 1.3 离层的形成
• 1.4 蕾铃脱落的生理原因
• 1.4.1 影响蕾铃脱落的环境因素
• 1.4.2 有机养料与蕾铃脱落的关系
• 1.5 受精作用与幼铃脱落的关系
• 1.5.1 环境对受精作用的影响
• 1.5.2 受精作用对于叶片同化产物运输分配的影响
• 1.6 激素与蕾铃脱落的关系
• 1.6.1 生长素
• 1.6.2 乙烯
• 1.6.3 赤霉素
• 1.6.4 脱落酸
• 1.6.5 逆境对激素平衡的影响
• 1.6.6 衰老因素
• 1.6.7 其他物质
• 1.7 病虫危害对蕾铃脱落的影响
• 1.8 机械损伤对蕾铃脱落的影响
• 1.9 分离植物差异表达的方法
• 1.9.1 差异显示PCR
• 1.9.2 cDNA代表性差异分析
• 1.9.3 cDNA-AFLP
• 1.9.4 抑制差减杂交
• 1.9.5 基因表达系列分析
• 1.9.6 基因芯片
• 1.10 本课题的研究意义和目的
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 缓冲液和培养基配方
• 2.2 处理与取材
• 2.3 组织学切片
• 2.4 提取总RNA和分离mRNA
• 2.4.1 提取总RNA
• 2.4.2 分离mRNA
• 2.5 SSH差减文库的构建
• 2.5.1 cDNA第一链合成
• 2.5.2 cDNA第二链合成
• 2.5.3 RsaI酶切
• 2.5.4 接头连接
• 2.5.5 第一次杂交
• 2.5.6 第二次杂交
• 2.5.7 第一次PCR扩增
• 2.5.8 第二次PCR扩增
• 2.5.9 差减片段与载体的连接
• 2.5.10 连接产物转化
• 2.5.11 差减文库插入片断长度检测
• 2.6 差减基因片段的反向Northern杂交筛选
• 2.6.1 点膜
• 2.6.2 探针标记
• 2.6.3 反向Northern杂交筛选
• 2.7 差异表达克隆的挑取及测序
• 2.8 序列同源性检索
• 2.9 差异表达基因的RT-PCR分析
• 2.9.1 DNase处理
• 2.9.2 RNA定量
• 2.9.3 cDNA逆转录
• 2.9.4 PCR
• 3 结果和分析
• 3.1 赤霉素,乙烯对棉铃脱落的影响
• 3.2 离层细胞的组织学分析
• 3.3 总RNA含量和质量的检测
• 3.4 mRNA的质量检测
• 3.5 SSH文库的构建
• 3.6 文库装载和克隆挑选
• 3.7 文库初步筛选
• 3.7.1 PCR扩增筛选
• 3.7.2 反向Northern筛选
• 3.8 测序结果及其同源性分析
• 3.8.1 同源性检索
• 3.8.2 已测序EST序列分类
• 3.9 RT-PCR分析结果
• 4 讨论
• 4.1 关于脱落率的调查
• 4.2 关于抑制差减杂交的田间取材
• 4.3 离层总RNA的提取
• 4.4 差减文库的构建
• 4.5 离层差异表达基因的探讨
• 参考文献
• 致谢