人造特异性RNA内切酶治疗1型强直性肌营养不良症及优化PUF结构域的初步研究

论文摘要

1型强直性肌营养不良症（Myotonic dystrophy type1, DM1）是一种常染色体显性遗传病,其症状包括肌强直、肌肉萎缩、心脏传导缺陷、胰岛素耐受、白内障和认知缺陷等。DM1是最常见的成人肌营养不良症,全球发病率大概是1/8000。DM1是由于位于19q13.3染色体上的强直性肌营养不良蛋白激酶（myotonic dystrophy protein kinase, DMPK）基因3’端非翻译区的CTG重复序列异常扩增所致。DM1的发病机制尚不完全清楚,目前普遍认为是DMPK的mRNA发生了功能获得性突变,即异常扩增的CTG转录成有毒性的CUG RNA重复序列,并与一些转录因子和可变剪接调控因子等结合,形成核内聚集体（foci）,滞留在细胞核内,从而破坏基因的正常表达和可变剪接。目前研究最清楚的两类受CUG重复序列影响的剪接调控因子：Muscleblind样蛋白家族和CUG-BP, Elav-like蛋白家族,它们的异常表达造成许多下游目的基因的可变剪接发生异常。虽然通过反义寡核苷酸和RNAi等方法,DM1的症状可以得到一定的缓解,但到目前为止还不能完全治愈。我们探索一种利用人造特异性RNA内切酶（artificial site-specific RNA endonucleases, ASREs）治疗DM1的新方法。首先,通过重新编码得到特异性识别CUG重复序列的PUF结构域,并通过酵母三杂交系统和凝胶迁移实验进行验证；其次,通过将重新编码的PUF结构域与PIN结构域（RNA内切酶结构域）融合得到ASREs,其能够在培养细胞中特异性降解异常扩增的CUG重复序列；再次, ASREs的表达能够显著性减少DM1病人细胞中核内聚集体的数量；此外,ASREs的表达能够有效地逆转DM1病人细胞中IR、BIN1、cTNT、Nfix、SMYD1和SERCA1基因的异常剪接。总之,ASREs为DM1治疗提供了一种新的基因治疗策略。ASREs在DM1病人细胞中的应用取得了令人满意的效果,然而由于天然PUF结构域含有8个重复序列,即只能识别8个连续的RNA碱基,导致ASRE识别靶标序列的特异性有限,可能存在脱靶的现象,因此我们进一步研究并优化PUF结构域的RNA结合特性。首先,通过增加重复序列的数量来提高PUF结构域的结合特性,随着重复序列数目的增加,PUF结构域激活下游报告基因的能力也随之增强,当重复序列数目达到9时, LacZ活性达到顶峰；其次,通过改良PUF结构域,得到了结合RNA能力更强的PUF结构域。通过对PUF结构域结合特性的改造和优化,将为模块化的PUF结构域的应用打下基础。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 术语表
• 目次
• 第1章 绪论
• 1.1 DM1的遗传信息
• 1.2 基因型与表型的关系
• 1.3 CUG重复序列的结构
• 1.4 DM1的发病机制
• 1.4.1 DMPK单倍剂量不足（haploinsufficiency）
• 1.4.2 CTG重复序列附近的基因功能缺失
• 1.4.3 RNA功能获得（RNA gain of function）
• 1.5 DM1的治疗
• 1.5.1 在DNA水平上靶向重复序列的扩增和不稳定性
• 1.5.2 在RNA水平上降解或者中和突变的DMPK RNA
• 1.5.3 在蛋白质水平上改变RNA结合蛋白的表达量
• 1.5.4 逆转下游基因的异常剪接
• 1.6 本文的主要研究内容
• 第2章 材料与方法
• 2.1 试剂和耗材
• 2.2 仪器设备
• 2.3 常见试剂配制
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 PUF的构建
• 2.4.2 标靶载体的构建
• 2.4.3 PUF原核表达载体构建
• 2.4.4 ASRE构建
• 2.4.5 ASRE慢病毒载体构建
• 2.4.6 酵母三杂交酵母转化活性测定
• 2.4.7 PUF蛋白表达纯化
• 2.4.8 凝胶迁移实验（Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA）
• 2.4.9 细胞培养
• 2.4.10 脂质体转染
• 2.4.11 Trizol提取RNA
• 2.4.12 制备cDNA
• 2.4.13 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）
• 2.4.14 Western免疫印迹（Western blot）
• 2.4.15 成纤维细胞转化为肌细胞
• 2.4.16 荧光原位杂交技术（FISH）
• 2.4.17 FISH结合免疫荧光技术
• 2.4.18 RNA剪接实验分析
• 第3章 运用人造特异性RNA内切酶治疗DM1的研究
• 3.1 研究背景与立项依据
• 3.2 实验结果与分析
• 3.2.1 构建结合CUG重复序列的PUF结构域
• 3.2.2 构建切割CUG重复序列的ASREs
• 3.2.3 ASREs的表达降解DM1细胞中异常扩增的CUG重复序列
• 3.2.4 ASREs的表达对正常细胞中DMPK无显著影响
• 3.2.5 ASRE对DM1细胞中含有CTG重复序列其他基因无显著影响
• 3.2.6 ASRE减少DM1细胞中核内聚集体的数量
• 3.2.7 ASRE减少DM1细胞中MBNL1的沉积
• 3.2.8 ASREs逆转DM1病人细胞的异常剪接
• 3.2.9 ASREs对正常细胞的可变剪接无显著影响
• 3.3 讨论
• 第4章 优化PUF结构域RNA结合特性的研究
• 4.1 研究背景与立项依据
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 构建含多个重复序列的PUF结构域
• 4.2.2 新构建的PUF结构域第四个重复序列的兼容性
• 4.2.3 PUM1结构的微调
• 4.3 讨论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 创新之处
• 5.3 未来的工作及展望
• 5.3.1 优化ASRE使其特异性识别并有效地切割CUG重复序列
• 5.3.2 研究ASRE对整个转录组的影响
• 5.3.3 研究ASRE在DM1小鼠模型中的作用
• 5.3.4 拓展ASRE的应用
• 5.3.5 PUF结构域的探索与应用
• 参考文献
• 附录
• 作者简历
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 附件