Rapamycin对同种移植耐受模型中CD4～+ CD25～+调节性T细胞活性影响的实验研究

论文摘要

研究目的CD4+CD25+调节性T细胞（Treg）是近来发现的具有强有力免疫负调节作用的T细胞重要类型之一。最近研究显示，Treg参与多种途径诱导的移植免疫耐受。因此深入研究影响和调控Treg活性的因素及其机理，对诱导移植耐受，从根本上解决临床器官移植排斥问题，具有重要意义。然而目前临床广泛应用于器官移植的免疫抑制剂对CD4+CD25+调节性T细胞的影响及其机理尚不明确。Rapamycin（雷帕霉素，Rapa）作为一种新型大环内酯类免疫抑制剂，其独特的免疫抑制作用在器官移植领域已经受到高度重视。近来研究报道Rapa在体外可以选择性地扩增正常小鼠的天然CD4+CD25+调节性T细胞，而不阻断该小鼠CD4+T细胞的扩增和活化诱导细胞凋亡，但其确切机制尚不清楚。此外，有研究报道，IL-2作为一种经典的T细胞生长因子，同时也调控调节性T细胞诱导免疫耐受的过程，影响调节性T细胞的功能并维持其竞争适应性。但是在移植耐受诱导过程中IL-2与Rapa之间有无相互作用尚不清楚。本实验室前期研究发现，在传统免疫抑制剂环孢霉素A（CsA）诱导的同种移植耐受模型中，CD4+CD25+Foxp3+表达升高，并与移植物生存时间呈正相关。但是Rapa是否也影响同种移植个体的Treg活性，能否在体外扩增移植耐受模型的CD4+CD25+调节性T细胞并保持其免疫抑制活性方面，目前尚未见研究报道。本实验采用小鼠同种皮肤移植模型，以Rapa／CsA对同种移植模型进行耐受诱导。研究Rapa体外对移植耐受模型中CD4+CD25+Foxp3+Treg活性的影响。同时研究在不同剂量IL-2存在条件下，Rapa介导同种皮肤移植免疫耐受的有效方式和使用剂量，并研究经Rapa处理的耐受模型的CD4+T细胞对介导过继移植免疫耐受的应用效果。实验方法以B6小鼠为供体，BABL／c和BABL／c-SCID小鼠分别为受体，建立小鼠同种皮肤移植模型。移植术前一天供体脾细胞预先注射，移植后BABL／c小鼠分别给予免疫抑制剂Rapa（0.5mg／kg）或CsA（10mg／kg）腹腔注射进行耐受诱导。移植后第14天提取耐受诱导的BABL／c小鼠脾细胞（术后第14天对照组移植皮片全部排斥），纯化T细胞和CD4+T细胞，经不同浓度Rapa和／或IL-2体外处理后，通过MLR确定T细胞特异性回忆反应；流式细胞术检测CD4+CD25+Treg细胞比例变化；RT-PCR检测Foxp3 mRNA表达情况；ELISA检测T细胞培养上清中IL-10浓度的变化。然后将经过Rapa体外处理的CD4+T细胞过继转输给BALB／c-SCID小鼠同种移植模型，逐日观察移植物存活状态。实验结果1．与对照组相比（13.2±1.5d），移植后体内应用雷帕霉素加供体脾细胞预先注射，移植皮片存活期明显延长（22.8±2.1d），P＜0.05。CsA加供体脾细胞预先注射，移植皮片存活期也明显延长（22.0±1.9d），与Rapa处理组相比无显著差异，但是小鼠的一般状况较差，体重明显下降。2．移植耐受模型鼠的T细胞经Rapa体外处理不同时间（24、48、72、96h）后，与未处理组相比，Rapa单独处理在第72h可以使T细胞特异性增殖水平降低，联合IL-2共同处理时T细胞特异性回忆应答反应最弱。同期T细胞培养上清中IL-10水平与T细胞特异性回忆反应的变化一致。3．移植后第14天耐受模型组提取的T细胞或CD4+T细胞经低浓度Rapa（100nM）体外处理72h后，与未经Rapa处理的对照组相比，CD4+CD25+T细胞数量增多，Foxp3表达量增加，而联合低浓度IL-2（50IU／ml）后其上调CD4+CD25+T细胞数量的比例较二者单独应用均明显提高。4．耐受模型小鼠脾CD4+T细胞经Rapa体外处理后再过继转输给同种移植的BALB／c-SCID鼠后，其移植皮片存活时间显著延长（P＜0.05）。结论1．体内应用Rapa或CsA加供体脾细胞预先注射均可明显延长同种移植皮片的存活时间，诱导移植耐受，Rapa效果优于CsA。2．Rapa体外处理同种移植耐受模型鼠T细胞和CD4+T细胞的有效使用剂量是100 nmol／L，最佳作用时间是72h。3．Rapa在体外可以扩增移植耐受模型中CD4+CD25+T细胞的数量，增加Foxp3表达量，低浓度IL-2（50IU／ml）可以协同增强Rapa这一作用。4．Rapa诱导的Treg其功能的发挥不依赖于IL-10的产生，但其功能的激活有赖于IL-2的存在。5．耐受诱导产生的CD4+CD25+Treg，经Rapa体外处理后过继转移，仍保持其免疫负调节作用，明显延长同种移植物存活时间。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 一、前言
• 二、实验材料和方法
• （一） 实验材料
• 1.建立小鼠同种皮肤移植模型的相关实验材料
• +T细胞的实验材料'>2.制备小鼠脾细胞及纯化T细胞和CD4⁺T细胞的实验材料
• 3H—TdR掺入法）的实验材料'>3.混合淋巴细胞反应（³H—TdR掺入法）的实验材料
• 4.细胞总RNA提取的实验材料
• 5.RT反应的实验材料
• 6.PCR反应的实验材料
• 7.DAN电泳的实验材料
• 8.流式细胞术所用实验材料
• 9.测定LI-10的实验材料及仪器
• 10.实验用药物
• （二） 实验方法
• 1.小鼠同种皮肤移植模型的制备
• +T细胞介导的SCID小鼠同种皮肤移植模型制备'>2.CD4⁺T细胞介导的SCID小鼠同种皮肤移植模型制备
• 3.同种移植模型的耐受诱导及分组
• 4.皮肤移植物排斥的组织学鉴定
• +T细胞的实验方法'>5.制备脾T细胞和CD4⁺T细胞的实验方法
• +T细胞和T细胞体外培养'>6.脾CD4⁺T细胞和T细胞体外培养
• +CD25⁺T细胞比例'>7.流式细胞术测定CD4⁺CD25⁺T细胞比例
• 3H—TdR掺入法）'>8.混合淋巴细胞反应（³H—TdR掺入法）
• 9.TRIzol一步法提取细胞总RNA
• 10.RT-PCR
• 11.PCR产物琼脂糖凝胶电泳
• 12.ELISA法测定IL-10
• 13.过继转移实验
• 14.统计学分析
• 三、实验结果
• （一） 体内实验结果
• 1.移植皮片存活曲线
• 2.移植皮片排斥状况及小鼠一般状况
• 3.小鼠同种移植后移植皮片的组织学鉴定
• （二） 体外实验结果
• +CD25⁺T细胞比例'>1.流式细胞术检测CD4⁺CD25⁺T细胞比例
• 2.混合淋巴细胞反应检测T细胞特异性增殖水平
• 3.ELISA检测IL-10水平
• 4.RT-PCR检测Foxp3表达状况
• （三） 过继免疫反应实验结果
• +T细胞后移植皮片存活情况'>1.过继输入CsA组CD4⁺T细胞后移植皮片存活情况
• +T细胞后移植皮片存活情况'>2.过继输入雷帕霉素组CD4⁺T细胞后移植皮片存活情况
• 四、讨论
• 1.诱导模型耐受的药物选择
• +CD25⁺调节性T细胞影响'>2.Rapa体外作用对耐受模型CD4⁺CD25⁺调节性T细胞影响
• 3.过继转移实验
• 五、小结
• 六、参考文献
• 七、致谢
• 八、攻读硕士期间发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表