论文摘要
鼻咽癌（NPC）是我国南方地区常见的一种恶性肿瘤,其发病机制还不清楚。DNA甲基化修饰是基因表达调控的重要表观遗传学机制之一,DNA甲基化修饰导致抑瘤基因等的沉默在癌变过程中发挥重要的作用。因此,筛选NPC的甲基化失活基因将有助于揭示NPC的发病机制,具有重要的理论和应用价值。本研究室前期采用蛋白质组学技术比较激光捕获显微切割纯化的NPC组织与正常鼻咽黏膜组织蛋白质表达谱的差异,发现NPC组织中14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1蛋白质表达降低,但其表达下调的机制不清楚。为探讨NPC 14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因表达下调是否由启动子甲基化引起,本研究以4株具有不同分化程度和转移潜能的NPC细胞系（CNE1、CNE2、5-8F、6-10B）、1株永生化的鼻咽上皮细胞系NP69,以及75例NPC组织和25例正常鼻咽黏膜组织作为实验对象,采用甲基化特异性PCR（MSP）、RT-PCR、Western blotting和免疫组织化学分别检测14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因启动子甲基化情况、mRNA和蛋白质的表达水平;利用不同浓度（0、0.1、1、5、10μmol/L）的去甲基化药物5-杂氮-2′-脱氧胞苷（5-aza-2dC）处理NPC细胞株,采用MTT比色检测细胞生长,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡。主要结果如下:（1）与正常鼻咽黏膜组织比较,NPC组织14-3-3σ（84%VS 28%）、Annexin A1（92%VS 12%）和SCCA1（87%VS 22%）基因启动子出现高频甲基化;（2）在14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因启动子完全甲基化NPC组织中,其mRNA和蛋白质的表达缺失;在14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因启动子不完全甲基化NPC组织中,其mRNA和蛋白质的表达显著低于未甲基化的NPC组织;14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因甲基化与其表达水平高度负相关;（3）14-3-3σ、Annexin A1、SCCA1基因启动子甲基化与NPC淋巴结转移正相关;（4）NP69细胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因启动子未甲基化,4株NPC细胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因启动子均存在不同程度的甲基化,而且其甲基化程度与细胞系的分化程度和转移潜能有关,分化程度越低甲基化程度越高,转移潜能越大甲基化程度越高;（5）NPC细胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1mRNA表达水平低于NP69细胞;（6）5-aza-2dC呈浓度依赖性地抑制4株NPC细胞系14-3-3σ、Annexin A1和SCCA1基因甲基化,上调其mRNA和蛋白质的表达;（7）5-aza-2dC呈浓度依赖性地抑制4株NPC细胞系的生长,促进细胞凋亡,导致细胞周期阻滞,而且高分化CNE1和无转移6-10B细胞对药物的敏感性高于低分化CNE2和高转移5-8F细胞。本研究首次报道14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因在NPC中出现高频甲基化,启动子甲基化是导致NPC 14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因表达缺失或降低的原因之一,14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1基因是新的NPC甲基化沉默基因;本研究发现14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1启动子甲基化与NPC淋巴结转移正相关,提示14-3-3σ、AnnexinA1和SCCA1启动子甲基化可能成为预测NPC转移的指标;本研究结果显示去甲基化药物5-aza-2dC能抑制NPC细胞生长、促进NPC细胞凋亡,提示去甲基化药物可能具有治疗NPC的作用。
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