CTB-LK密码子多点突变及其优化基因在毕赤酵母中的表达

论文摘要

CTB-LK是将蚓激酶（LK）和霍乱毒素B型亚单位（CTB）通过基因融合,并在毕赤酵母中获得表达的一种新型抗血栓肠吸收蛋白,经过体外和小鼠体内实验均证明CTB-LK具有很好的预期酶活和高效肠吸收特性。为提高CTB-LK的表达量,本研究以实验室已有的CTB-LK基因为基础,在不改变所编码氨基酸的情况下,使用基因重叠延伸PCR（gene SOEing PCR）技术,对该基因中4个编码氨基酸的密码子位点进行定点突变,将4个毕赤酵母稀有密码子分别突变成毕赤酵母高频密码子。并构建了优化基因CTB-LKA的中间克隆载体pBluescript SK-CTB-LKA和毕赤酵母表达载体pPIC9k-CTB-LKA,电击转化毕赤酵母GS115,筛选获得了CTB-LKA毕赤酵母表达菌株。对CTB-LKA毕赤酵母发酵产物进行的SDS-PAGE实验表明,在45kD处出现了预期条带。在纤维平板溶栓实验中,发酵产物表现出纤维蛋白溶解酶的活性,表明CTB-LKA蛋白在毕赤酵母内得到了正确的表达和折叠。与同等体积CTB-LK毕赤酵母表达菌株发酵产物的SDS-PAGE电泳条带对比,前者在45kD处的条带更明显。通过使用纤维蛋白平板实验对CTB-LKA毕赤酵母表达菌株发酵产物溶纤活性测定结果表明,在BMGY/BMMY培养基中诱导36h后,酶活力达2450mm2/mL,比CTB-LK毕赤酵母表达菌株发酵产物酶活性提高了1.9倍。以上结果表明,经过密码子优化的CTB-LKA基因与未经过密码子优化的CTB-LK基因相比在毕赤酵母内的表达量得到了提高。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 蚓激酶及其研究进展
• 1.1.1 概述
• 1.1.2 蚓激酶的生理学特征
• 1.1.3 蚓激酶的溶栓机理
• 1.1.4 蚓激酶的临床应用
• 1.1.5 蚓激酶的基因工程表达研究
• 1.2 霍乱毒素（cholera toxin，CT）及其B 型亚单位（CTB）
• 1.3 表达载体的密码子偏好性及优化
• 1.3.1 生物密码子分析现状
• 1.3.2 密码子偏好性
• 1.3.3 密码子的优化
• 1.4 毕赤酵母表达系统
• 1.4.1 毕赤酵母表达系统的优点
• 1.4.2 毕赤酵母表达宿主菌
• 1.4.3 毕赤酵母表达载体
• 1.4.4 外源蛋白在毕赤酵母中的表达
• 1.4.5 巴斯德毕赤酵母的生物学特性
• 1.4.6 巴氏毕赤酵母的分子生物学特性
• 1.4.7 影响异源蛋白在巴斯德毕赤酵母中表达水平的因素
• 第二章 对CTB-LK 基因密码子的优化
• 2.1 材料和试剂
• 2.1.1 引物
• 2.1.2 工具酶和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 DNA 的琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.2 从琼脂糖中回收DNA
• 2.2.3 普通PCR
• 2.2.4 重叠延伸PCR 技术
• 2.3 结果与分析
• 第三章 毕赤酵母表达载体构建
• 3.1 材料和试剂
• 3.1.1 质粒、菌株和引物
• 3.1.2 主要实验仪器
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 主要溶液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
• 3.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB 法）
• 3.2.3 DNA 的限制酶消化
• 3.2.4 DNA 的连接反应
• 3.2.5 菌体生长量的检测
• 3.2.6 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 中间载体pBluescript SK-CTB -LKA 的构建
• 3.3.2 毕赤酵母表达CTB-LKA 的载体构建
• 3.4 实验操作过程中的遇到的一些问题
• 3.4.1 酶切注意事项
• 3.4.2 外源基因与表达载体的连接
• 3.4.3 PCR 常见问题
• 3.5 小结
• 第四章 CTB-LKA 在毕赤酵母中的表达及验证
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 质粒和菌株
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 试剂
• 4.2.4 培养基及主要溶液
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 毕赤酵母的转化
• 4.3.2 转化子的筛选
• 4.3.3 酵母菌落PCR 筛选阳性克隆
• 4.3.4 毕赤酵母总RNA 提取
• 4.3.5 毕赤酵母的诱导表达
• 4.3.6 发酵上清液中蛋白的提取
• 4.3.7 SDS-PAGE 蛋白质凝胶电泳
• 4.3.8 纤维蛋白平板检验生物活性
• 4.4 结果讨论
• 4.4.1 毕赤酵母的转化
• 4.4.2 毕赤酵母的转化后G418 筛选
• 4.4.3 菌落PCR 筛选效果
• 4.4.4 纤维蛋白平板法测定外源蛋白活性
• 4.4.5 上清液SDS-PAGE 检测
• 第五章 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢