大肠杆菌产CotA蛋白的高效诱导表达、分离纯化及酶学性质的研究

论文摘要

CotA漆酶在环境保护、食品工业和纸浆漂白等工业中具有重要的应用价值。由东北林业大学微生物实验室构建并保存的含表达载体的pET-22b（+）/cotA转入到Escherichia coli BL21（DE3）中,得到工程菌株。采用单因素实验和正交实验相结合的方法,研究异源诱导表达和发酵条件对重组大肠杆菌产CotA漆酶量的影响。通过渗透压破胞法释放粗CotA蛋白,并对其进行纯化、酶学性质及染料脱色等方面研究。（1）初始pH7.5的培养基中,500mL锥形瓶中装入150mL培养基,添加0.6mmol/L Cu2+,1g/L葡萄糖作碳源、15g/L蛋白胨和2g/L硫酸铵作氮源,以3%的接种量,37℃180r/min,直到菌液的OD6oo nm值为1.0,加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG,25℃诱导12h,漆酶的产量最高。优化前发酵液的粗提液的漆酶活性仅为1190U/mL,优化后达到3526U/mL,正交实验优化后漆酶活性提高了2.96倍。（2）本文使用纯化方法（硫酸铵盐析、半透膜透析、PEG20000浓缩、DEAE-Sepharose FF离子交换层析、Sephadex G-75凝胶过滤）,从含CotA漆酶粗提液中纯化出CotA漆酶,纯化的重组漆酶在SDS-PAGE上显示单一条带,大小约为67.5kDa,与天然CotA分子量大小（65kDa）相似。最终回收率为27.83%,纯化倍数为5.26。纯化的CotA漆酶经过Native-PAGE后,可以使丁香醛连氮（3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲醛）显红色。（3）对菌株E. coli BL21（DE3）所产CotA漆酶的酶学性质进行研究。纯化CotA漆酶与原始芽孢漆酶有一系列相似的特性。其最适反应温度为45℃,和最适反应pH为7.2。pH7.2条件下,80℃时CotA漆酶活性半衰期tl/2为0.5h。在最适反应温度45℃下,pH9.0时CotA漆酶活性半衰期t1/2达到8h。Cu2+和Ca2+对CotA漆酶活性的提高有较强促进作用；EDTA和Zn2+对CotA漆酶的活性有很强抑制作用；而K+、Na+和Fe2+对CotA漆酶的影响不大；以丁香醛联氮为底物,测得该酶Km值为1.10mmol/mL。（4）CotA漆酶能够在12h内有效降解不同的偶氮和葸醌染料,如RBBR.刚果红、甲基橙和结晶紫的降解率分别为93.15%、90.03%、59.92%和55.14%。这样的降解能力使得该工程菌株应用于废水中染料降解成为现实。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 CotA蛋白
• 1.1.1 CotA蛋白的来源和位置
• 1.1.2 CotA蛋白的特性
• 1.1.3 CotA蛋白的同源性
• 1.1.4 CotA蛋白的结构
• 1.2 漆酶的种类
• 1.3 有关细菌漆酶的研究
• 1.3.1 细菌漆酶的生物学研究
• 1.3.2 细菌漆酶的培养条件的优化技术
• 1.3.3 细菌漆酶酶活的测定
• 1.4 CotA漆酶的应用前景
• 1.4.1 环境保护
• 1.4.2 造纸工业
• 1.4.3 生物燃料电池
• 1.4.4 其他领域
• 1.5 本课题来源及研究目的和意义
• 1.5.1 课题来源
• 1.5.2 本研究的目的和意义
• 1.6 展望
• 2 大肠杆菌BL2 1（DE3）产CotA漆酶的发酵条件优化
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 药品及试剂配制
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 CotA漆酶的制备
• 2.2.2 CotA漆酶酶活的测定
• 2.2.3 SDS-PAGE
• 2.2.4 诱导条件的测定
• 2.2.5 工程菌株产CotA漆酶最适培养条件的优化
• 2.2.6 工程菌株产CotA漆酶最适培养基的优化
• 2.3 分析
• 2.3.1 CotA漆酶最佳诱导条件的测定
• 2.3.2 产酶最适培养环境的优化
• 2.3.3 培养基对工程菌株产漆酶的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 大肠杆菌BL21（DE3 ）产CotA漆酶纯化方法研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 药品和试剂
• 3.1.4 仪器与设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 CotA的诱导表达
• 3.2.2 CotA漆酶酶活的测定及蛋白含量的测定
• 3.2.3 硫酸铵盐析
• 3.2.4 透析
• 3.2.5 聚乙二醇（PEG20000）浓缩
• 3.2.6 DEAE-Sepharose FF（1.6×50 cm）离子交换层析
• 3.2.7 SephadexG-75凝胶过滤（1.6×50cm）
• 3.2.8 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 硫酸铵最佳饱和度选择
• 3.3.2 离子交换层析上样缓冲体系pH值及洗脱离子强度的确定
• 3.3.3 DEAE-Sepharose离子交换层析
• 3.3.4 Sephadex G-75凝胶过滤
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 4 纯化CotA漆酶的酶学性质研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 试剂和药品
• 4.1.3 仪器与设备
• 4.2 方法
• 4.2.1 纯化的CotA漆酶的制备
• 4.2.2 CotA漆酶酶活的测定
• 4.2.3 CotA漆酶酶学性质研究
• 4.2.4 CotA漆酶染料降解研究
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 CotA漆酶酶学性质
• 4.3.2 染料脱色
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录A 主要试剂
• 附录B 主要试剂配制方法
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢