白菜花组织再生体系的建立及离体条件下阶段发育转变的研究

论文题目: 白菜花组织再生体系的建立及离体条件下阶段发育转变的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 孙保娟

导师: 曹家树

关键词: 白菜,花托,花柄,不定芽,离体开花,离体春化,基因

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 白菜是十字花科芸薹属的一种重要蔬菜,目前其优良品种选育借助的主要手段还是杂种优势利用。本文针对雄性不育亲本保存和繁殖上存在的一些问题,采用带柄及子房的花托、带子房的花托、花柄和花序轴等4种不同外植体,进行了再生体系的研究筛选,并对再生体系建立中出现的一些现象进行了观察分析,进而以不定芽为材料,研究了不定芽离体春化反应特性、抗氧化酶活性及可溶性蛋白含量变化与春化作用的关系,借助cDNA-AFLP技术分离离体条件下与春化反应相关的EST。主要研究结果如下: （1）核雄性不育两用系‘ZUB97-01AB’不育株和可育株,以带柄及子房的花托为外植体,再生频率因育性的不同而出现了差异。在BAP浓度固定为2 mg·L-1的条件下,可育在NAA浓度0.1rag-L-1时获得最高的再生频率72.6%,不育在NAA浓度0.2 mg·L-1时获得最高的再生频率77.1%,在各自相对最适的NAA浓度下,可育株对BAP浓度要求严格,不育株相对宽泛。带柄及子房的花托,带子房的花托,花柄和花序轴这几种外植体都能再生不定芽,但就诱导率和芽的发生速度而言,以带柄及子房的花托为最理想。总体来说,可育外植体再生表现要优于不育外植体。（2）不育株和可育株外植体内源激素含量有所差异,前者GA3,IAA和ZT含量均比后者高。这能用来解释不育和可育外植体再生的差异。（3）来源于花组织的再生芽以有丝分裂的形式传承了母体的春化态,所以导致高频试管开花;这种生殖生长趋势会随着继代扩繁时间的增加逐渐减弱。这种不定芽生长状态的改变是多种因素综合作用的结果,培养基的基本成分,外源激素,细胞的分化形式都可能与此有关。（4）经多次继代后得到的营养芽在5℃低温下处理14 d时就能够重新获得春化态,在生根培养过程中抽薹开花,5℃条件下,14 d的处理是本材料可以通过春化的临界时间,要保证获得较高水平的春化态,春化处理时间应在21 d以上。低温处理21 d后再进行脱春化处理,不能完全实现脱春化。（5） GA3能够部分代替低温的作用,添加到生根培养基中,能够诱导不定芽开花,但同时造成生根困难。赤霉素诱导与低温春化诱导后开花表现有所不同,GA3诱导产生花台的速度及高度不及后者。它们是有交叉作用,但又是有本质不同的两种开花途径。（6）再生可育株和不育株小孢子发育进程与母体基本一致,不育小孢子败育发生在减数分裂Ⅱ这一阶段。在离体成花条件下,可育株小孢子不能正常发育,最终导致败育。（7）在超长时间的春化处理下,不定芽在感受低温作用通过春化发育后,在低温无光的条件下会继续进行开始花芽分化,形成花原基;即使在花芽分化程度比较高的情况下,因BAP的作

论文目录:

缩写词

摘要

Abstract

前言

1 文献综述

1.1 芸薹属再生体系建立的基本情况

1.1.1 采用的外植体类型

1.1.2 培养基组成

1.1.3 芸薹属植物建立再生体系过程中存在的问题

1.1.3.1 玻璃化现象

1.1.3.2 离体成花现象

1.2 植物成花研究进展

1.2.1 植物几种主要的成花途径

1.2.1.1 春化需求型

1.2.1.2 光周期和光质需求型

1.2.1.3 自主开花途径

1.2.1.4 赤霉素途径

1.2.1.5 各种开花途径的整合

1.2.1.6 开花途径的决定

1.2.2 植物春化作用的生理生化基础

1.2.2.1 植株一般的春化反应特性

1.2.2.2 抗氧化酶系统与春化的关系

1.2.2.3 抗氧化物质谷胱苷肽与春化的关系

1.2.2.4 核酸、蛋白质代谢与春化的关系

1.2.2.5 DNA甲基化与春化的关系

1.2.2.6 植物激素与春化的关系

1.2.3 植物春化作用的分子机理

1.3 植物离体成花研究进展

1.3.1 离体成花研究所采用的材料

1.3.1.1 营养芽

1.3.1.2 胚轴与茎段

1.3.1.3 花相关组织

1.3.1.4 子叶

1.3.1.5 薄细胞层

1.3.2 影响离体成花的因素

1.3.2.1 营养条件

1.3.2.2 培养物种类及部位

1.3.2.3 外源激素

1.3.3 开花逆转

1.4 差异表达基因克隆策略

1.4.1 从cDNA文库筛选差异表达基因

1.4.2 DD-PCR方法和差减杂交法及改进

1.4.2.1 代表性差异分析法

1.4.2.2 RC4D法

1.4.2.3 cDNA-AFLP法

1.4.2.4 SAGE法

1.4.2.5 差异消减展示

1.4.2.6 PACS法

1.4.2.7 多轮LD-PCR与差减杂交相结合直接克隆全长差异表达基因

1.4.3 差异表达基因克隆策略在克隆春化作用相关基因上的应用

2 白菜不同花组织外植体再生差异的比较分析

2.1 材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 外植体消毒

2.1.3 培养基组成和培养条件

2.1.4 外植体内源激素含量测定

2.1.5 不育和可育外植体主要农艺性状比较

2.1.6 不定芽离体生根及花序轴段扦插

2.2 结果与分析

2.2.1 带柄及子房的花托在不同BAP／NAA浓度配比培养基上的分化

2.2.2 BAP和NAA对愈伤组织及不定芽分化的影响

2.2.3 不同BAP／NAA浓度配比对带柄及子房花托外植体分化的影响

2.2.4 不同育性花柄对NAA需求的比较

2.2.5 不同外植体不定芽诱导情况比较

2.2.6 不定芽离体成花

2.2.7 不定芽生根及移栽中出现的一些现象

2.2.8 白菜核不育两用系可育株与不育株外植体内源激素比较

2.2.9 不育株和可育株各种外植体性状比较

2.3 讨论

2.3.1 内源激素含量与激素配比对不同育性植株再生的影响

2.3.2 不同外植体内源激素含量对再生频率的影响

2.3.3 外植体育性对不定芽再生的影响

2.3.4 来源花组织的外植体再生时的离体成花现象

2.3.5 来源花组织的外植体再生时的玻璃化现象

3 白菜花组织再生不定芽继代培养过程中阶段发育的转变

3.1 材料与方法

3.1.1 继代培养的不定芽材料及方法

3.1.2 不定芽离体春化

3.1.3 赤霉素处理对白菜不定芽成花诱导

3.1.4 不育和可育花组织再生植株的小孢子发育的细胞学观察

3.1.5 离体条件下低温春化处理后花芽分化观察

3.2 结果与分析

3.2.1 不同继代培养时期离体成花及不定芽性状表现

3.2.1.1 不同继代培养时期对不定芽离体现蕾率影响

3.2.1.2 不同继代培养时期对不定芽离体生根的影响

3.2.1.3 继代培养时期对不定芽生长状态的影响

3.2.2 不同时间低温春化处理对不定芽性状表现的影响

3.2.2.1 不同时间低温春化处理对不定芽离体成花的影响

3.2.2.2 不同时间低温处理对生根的影响

3.2.2.3 不同时间低温处理对不定芽叶片数的影响

3.2.2.4 春化态不定芽在不同培养基上的表现

3.2.3 赤霉素处理对脱春化不定芽成花和生根的影响

3.2.3.1 赤霉素处理对脱春化不定芽成花的影响

3.2.3.2 赤霉素处理对脱春化不定芽生根的影响

3.2.3.3 低温春化和赤霉素处理诱导成花的比较

3.2.4 可育株和不育株再生植株的小孢子发育的观察

3.2.4.1 可育再生植株的小孢子发育

3.2.4.2 不育再生植株的小孢子败育过程

3.2.4.3 可育再生植株试管成花败育的原因

3.2.4.4 可育植株自交表现

3.2.5 低温春化处理离体条件下花芽分化

3.3 讨论

3.3.1 继代培养时间对不定芽的影响

3.3.1.1 继代培养中生殖生长趋势减弱

3.3.1.2 继代培养中营养生长和生殖生长优势转变

3.3.2 低温处理时间对不定芽性状表现的影响

3.3.3 赤霉素的成花诱导作用

3.3.4 再生植株育性表现

3.3.5 离体花芽分化

4 白菜离体春化的生理基础

4.1 材料及方法

4.1.1 白菜不定芽扩繁

4.1.2 白菜不定芽离体低温春化处理

4.1.3 样品制备及主要指标测定方法

4.1.4 SDS-PAGE分析

4.1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

4.2 结果与分析

4.2.1 低温处理不同时间对不定芽各组织SOD活性的影响

4.2.2 低温处理不同时间对不定芽各组织APX活性的影响

4.2.3 低温处理对不定芽各组织CAT活性的影响

4.2.4 低温处理不同时间对不定芽各组织POD活性及谱带分布的影响

4.2.5 不同春化处理时间对不定芽各组织MDA含量的影响

4.2.6 低温处理不同时间对不定芽各组织可溶性蛋白质含量及组成的影响

4.3 讨论

4.3.1 各种抗氧化酶与春化作用的可能关系

4.3.2 MAD含量变化与春化作用的关系

4.3.3 可溶性蛋白含量变化与春化作用的关系

4.3.4 各组织的春化反应特性

5 白菜离体春化相关基因表达的cDNA-AFLP分析

5.1 材料与方法

5.1.1 不定芽扩繁

5.1.2 不定芽低温春化和脱春化处理

5.1.3 取样

5.1.4 RNA提取

5.1.4.1 器皿的准备

5.1.4.2 试剂

5.1.4.3 提取RNA的操作步骤

5.1.4.4 RNA检测所用试剂的配制及仪器的处理

5.1.4.5 RNA的检测

5.1.5 cDNA-AFLP分析获得离体春化作用相关的EST

5.1.5.1 cDNA第一链的合成

5.1.5.2 cDNA第二链的合成

5.1.5.3 cDNA酶切、连接

5.1.5.4 模板的预扩增和选择性扩增

5.1.5.5 变性

5.1.5.6 测序胶电泳

5.1.5.7 银染方法

5.1.5.8 差异片断的回收

5.1.5.9 片段连接、转化

5.1.6 差异片段的Northern杂交验证

5.1.6.1 RNA甲醛变性凝胶电泳

5.1.6.2 RNA转膜

5.1.6.3 杂交

5.1.7 RT-PCR检测

5.2 结果与分析

5.2.1 cDNA-AFLP分析

5.2.1.1 RNA提取和检测

5.2.2 cDNA合成

5.2.3 离体春化处理差异表达基因的cDNA-AFLP分析

5.2.4 差异片断的回收、克隆、测序

5.2.5 差异片断的半定量RT-PCR检验

5.2.6 A6T16-2表达特征的Northern杂交分析

5.3 讨论

5.3.1 春化处理特异表达的EST与春化作用的可能关系

5.3.1.1 A4T16V片断可能编码基因的功能

5.3.1.2 A1079V片断可能编码基因的功能

5.3.1.3 A14T5V片断可能编码基因的功能

5.3.2 春化处理后抑制性表达的EST与春化作用的可能关系

5.3.2.1 A5T16-1片断可能编码基因的功能

5.3.2.2 A6T17-1片断可能编码基因的功能

5.3.2.3 A6T16-2和A6717-2片断可能编码基因的功能

5.3.2.4 A11T19片断可能编码基因的功能

5.3.2.5 A19T7片断可能编码基因的功能

5.3.2.6 其它片断可能编码基因的功能

结论

参考文献

发布时间: 2005-07-22

参考文献

[1].砂梨果实成熟相关基因的克隆及其RNAi载体的构建[D]. 胡钟东.南京农业大学2007
[2].西瓜子叶再生机制及高效再生体系应用研究[D]. 张娜.华中农业大学2015
[3].甜橙和金柑高效安全转基因技术研究[D]. 杨莉.湖南农业大学2012

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