动物组织中莱克多巴胺残留免疫检测方法研究

论文摘要

本文以butane-1,4-diol diglycidyl ether作为连接臂,采用直接偶联法,将半抗原莱克多巴胺与载体蛋白-牛血清白蛋白（BSA）偶联作为免疫抗原RAC-BSA进行动物免疫,与辢根过氧化物酶（HRP）偶联得酶标抗原RAC-HRP,作为直接竞争酶联免疫的酶标记物;采用琥珀酸酐-混合酸酐法合成RAC-OVA,作为间接竞争的包被抗原进行抗血清效价测定。通过特定的免疫程序,免疫日本大耳白兔,获得了亲合性很高的抗莱克多巴胺的抗血清,经免疫亲和层析法纯化后获得多克隆抗体,建立直接竞争酶联免疫检测方法。结果表明,此方法具有较高的灵敏度,IC50为0.9ng/mL,检出限(IC15)为0.15 ng/mL;除了与多巴酚丁胺的交叉反应为7.5%外,与克伦特罗、沙丁胺醇、特步他林、异丙肾上腺素、和异奎胍均无交叉现象,说明抗体特异性较高。选择四种动物样品进行基质影响消除的研究,结果表明,采用PBS进行5倍提取后,便可消除基质影响,不需要有机溶剂和其他净化步骤,样品中的检出限达0.5μg/kg;在样品中添加三个水平的莱克多巴胺浓度,回收率达60%以上,为莱克多巴胺快速检测试剂盒的研制奠定了物质基础。为开发快速检测试剂盒,论文进一步验证了抗体和酶标抗原稳定性及贮存条件。研究表明,抗体和酶标在4℃条件下储存半年以上而不影响检测性能,有利于莱克多巴胺试剂盒的推广和应用,从而实现对莱克多巴胺的有效监控。在建立了莱克多巴胺酶联免疫检测方法的基础上,还研究建立了莱克多巴胺化学发光酶免疫分析方法,对实现莱克多巴胺的高灵敏度、快速检测具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.1.1 兽药和兽药残留现状
• 1.1.2 兽药残留的危害
• 1.1.3 兽药残留的控制措施
• 1.2 β-肾上腺素受体激动剂简介
• 1.2.1 β-肾上腺素受体激动剂结构与类型
• 1.2.2 β-激动剂的药理与毒理作用
• 1.3 莱克多巴胺简介
• 1.3.1 莱克多巴胺结构、性质
• 1.3.2 莱克多巴胺功能作用
• 1.3.3 莱克多巴胺毒性作用及限量标准
• 1.4 莱克多巴胺检测研究进展
• 1.4.1 常用的检测方法概述
• 1.4.2 色谱检测方法
• 1.4.3 免疫分析法
• 1.5 研究内容、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验样品
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 常用溶液的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 各种抗原的制备
• 2.2.2 抗体的制备与纯化
• 2.2.3 直接竞争酶联免疫（Direct competition ELISA, cdELISA）检测方法的建立
• 2.2.4 RAC-cdELISA各项指标的评价
• 2.3 莱克多巴胺快速检测试剂盒的研制
• 2.3.1 抗体稳定性实验
• 2.3.2 酶标抗原稳定性实验
• 2.4 增强化学发光酶联免疫分析（ECL-ELISA）方法的建立
• 2.4.1 测定步骤
• 2.4.2 基本工作浓度的优化
• 2.4.3 绘制标准曲线
• 2.4.4 样品基质研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 莱克多巴胺抗体的制备与选择
• 3.1.1 莱克多巴胺抗体的制备
• 3.1.2 抗血清效价和亲和性的测定
• 3.1.3 抗体的纯化
• 3.2 直接竞争ELISA各条件的优化
• 3.2.1 cdELISA最佳工作浓度的确定
• 3.2.2 cdELISA反应体系条件优化
• 3.3 直接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.3.1 直接竞争ELISA标准曲线的建立
• 3.3.2 灵敏度
• 3.3.3 精密度
• 3.3.4 特异性
• 3.3.5 准确度
• 3.4 试剂盒稳定性及保藏技术的研究与改进
• 3.4.1 抗体的稳定性
• 3.4.2 酶标抗原的稳定性
• 3.5 增强化学发光酶联免疫分析
• 3.5.1 包被抗体量的比较
• 3.5.2 不同酶标抗原稀释比例对ECL-ELISA灵敏度的影响
• 3.5.3 不同封闭液浓度对ECL-ELISA灵敏度的影响
• 3.5.4 RAC化学发光酶免疫分析的标准曲线
• 3.5.5 样品基质影响研究
• 3.5.6 小结
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士期间发表论文情况
• 8 致谢