凡纳滨对虾血细胞免疫抑制剂的筛选与免疫调控作用的研究

论文摘要

本文研究了凡纳滨对虾血细胞免疫抑制剂的筛选以及脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对对虾的免疫调控作用。主要内容包括:（1）凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）血细胞免疫活性培养方法的研究;（2）凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶、凝集素抑制剂筛选方法的研究;（3）脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾酚氧化酶原级联系统的影响。主要研究结果如下:1.凡纳滨对虾血细胞免疫活性培养方法的研究本文通过小鼠、兔、鲈鱼和人的ABO七种红细胞与凡纳滨对虾血清凝集素发生凝集反应,选择凝集效价最高的小鼠红细胞测定对虾血细胞凝集活性;同时本文选择了四种培养基成分进行凡纳滨对虾血细胞离体培养,结果表明:四种培养基对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和酚氧化酶原级联系统胞吐影响显著（P<0.05）,随着培养时间的延长,四种培养基各处理组血细胞数量、存活率和酚氧化酶原活力逐渐下降,而酚氧化酶活力逐渐升高。在12h内二号培养基总血细胞数量和血细胞存活率均显著高于一号、三号和四号培养基,四种培养基在3-6h内,血细胞存活率趋于稳定,6h之后逐渐下降;在0-3h内,培养基一号、三号和四号凝集活性升高,之后逐渐下降,而二号培养基3h内凝集活性没有发生变化,6h降低后趋于稳定;在0-6h内培养基一号酚氧化酶原活力高于其他各组,培养基二号酚氧化酶活力最低,在12h时培养基二号酚氧化酶原活力最高,酚氧化酶活力与其他三组无明显差异。由此得出结论,选择二号培养基进行凡纳滨对虾血细胞体外培养研究。2.凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶、凝集素抑制剂筛选方法的研究结果表明:三种浓度的酚氧化酶抑制剂p-APMSF对凡纳滨对虾血细胞数量和存活率影响显著（P<0.05）,随着培养时间的延长,各处理组血细胞数量、存活率逐渐下降。在6h内25μmol/L p-APMSF处理组显著高于50μmol/L和100μmol/L处理组;在1-6h内,25μm处理组血细胞数量变化不显著,但存活率差异显著;在实验时间内,各处理组凝集活性比对照组升高,处理组之间,50μm和100μm处理组凝集活性相同,25μm处理组凝集活性最低;25μm处理组酚氧化酶原活力和丝氨酸活力显著高于其他处理组,与p-APMSF浓度呈明显的负相关性。三种凝集素抑制剂对凡纳滨对虾血细胞数量和存活率影响显著（P<0.05）,在实验时间内,各处理组对虾血细胞数量和存活率逐渐下降,在3-6h内,200mM葡萄糖处理组血细胞数量和存活率高于其他处理组,且变化不显著;各处理组酚氧化酶活力逐渐升高,而血细胞酚氧化酶原活力逐渐下降;葡萄糖处理组对凡纳滨对虾凝集活性完全抑制作用。因此,选择葡萄糖作为凡纳滨对虾凝集素抑制剂进行相关研究。3.脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾酚氧化酶原系统的影响结果表明:脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾总血细胞数量（THC）酚氧化酶原proPO级联系统影响显著（P<0.05）。在实验时间内,各处理组血细胞数量和存活率均逐渐下降,与脂多糖处理组相比,脂多糖与凝集素抑制剂联合作用处理组血细胞数量和存活率低;与对照组相比,各处理组凡纳滨对虾凝集活性降低,3h内LPS处理组与对照组对虾凝集活性升高,而脂多糖与凝集素抑制剂联合作用处理组凝集活性降低;3-6h内,各处理组对虾凝集活性无显著变化;脂多糖、脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾胞吐酚氧化酶活力以及血细胞酚氧化酶原活力、血细胞丝氨酸蛋白酶原活力影响显著（P<0.05）。在实验时间内,各处理组酚氧化酶原活力和丝氨酸蛋白酶原活力均下降,与对照组相比,脂多糖处理组下降的幅度大;而酚氧化酶活力均升高。且各处理组血细胞胞吐酚氧化酶活力与培养时间呈明显的正相关性,而血细胞丝氨酸蛋白酶原活力和血细胞酚氧化酶原活力则与培养时间呈明显的负相关性。由此说明,凝集素在凡纳滨对虾免疫防御中发挥重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 甲壳动物免疫机制
• 1.1.1 细胞免疫
• 1.1.1.1 细胞防御反应
• 1.1.1.2 血细胞分类
• 1.1.2 体液免疫
• 1.1.2.1 酚氧化酶原激活系统
• 1.1.2.2 抗菌肽
• 1.1.2.3 溶菌酶
• 1.1.2.4 血蓝蛋白
• 1.1.2.5 蛋白酶抑制剂
• 1.2 甲壳动物酚氧化酶研究进展
• 1.2.1 酚氧化酶的理化性质
• 1.2.2 酚氧化酶的功能
• 1.3 甲壳动物凝集素研究进展
• 1.3.1 凝集素的理化性质
• 1.3.2 凝集素的功能
• 1.4 甲壳动物血细胞培养研究
• 1.4.1 研究进展
• 1.4.2 培养方法
• 1.4.2.1 培养环境及消毒
• 1.4.2.2 培养基的选择和优化
• 1.4.2.3 培养条件的确立
• 1.5 结语
• 2 凡纳滨对虾血细胞体外悬浮培养方法的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 培养基的配置
• 2.1.3 血细胞的体外悬浮培养
• 2.1.4 血清制备
• 2.1.5 血细胞的处理
• 2.1.6 实验设置
• 2.1.7 实验指标的测定
• 2.1.7.1 凡纳滨对虾血清凝集素凝集活性的测定
• 2.1.7.2 血细胞数量的测定
• 2.1.7.3 血细胞存活率的测定
• 2.1.7.4 血细胞酚氧化酶原活力的测定
• 2.1.7.5 血细胞释放的酚氧化酶活力的测定
• 2.1.7.6 培养液凝集活力的测定
• 2.1.8 数据处理与分析
• 2.2 实验结果
• 2.2.1 凡纳滨对虾血清凝集素凝集活性的测定
• 2.2.2 四种培养基对凡纳滨对虾血细胞数量和存活率的影响
• 2.2.3 四种培养基对凡纳滨对虾血细胞免疫因子的影响
• 2.2.4 四种培养基凝集活性的测定
• 2.3 讨论
• 3 凡纳滨对虾血细胞酚氧化酶、凝集素抑制剂筛选方法的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 血细胞体外悬浮培养
• 3.1.3 小鼠红细胞的制备
• 3.1.4 实验设置
• 3.1.5 实验指标的测定
• 3.1.5.1 血细胞数量及存活率的测定
• 3.1.5.2 凝集素活性的测定
• 3.1.5.3 血细胞释放的酚氧化酶活力的测定
• 3.1.5.4 血细胞酚氧化酶原活力的测定
• 3.1.5.5 丝氨酸蛋白酶原活性测定
• 3.1.6 数据处理与分析
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 p-APMSF 对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和酚氧化酶原系统的影响
• 3.2.2 三种凝集素抑制剂对凡纳滨对虾血细胞数量、存活率和酚氧化酶原系统的影响
• 3.3 讨论
• 3.3.1 p-APMSF 对凡纳滨对虾血细胞存活率和酚氧化酶原系统的影响
• 3.3.2 凝集素抑制剂对凡纳滨对虾血细胞存活率和酚氧化酶原系统的影响
• 4 脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾酚氧化酶原级联系统的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 血细胞体外悬浮培养
• 4.1.3 小鼠红细胞的制备
• 4.1.4 实验设置
• 4.1.5 实验指标的测定
• 4.1.6 数据处理与分析
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾血细胞数量和存活率的影响
• 4.2.2 脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾凝集活性和酚氧化酶原级联系统的影响
• 4.3 讨论
• 4.3.1 脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾血细胞存活率和数量的影响
• 4.3.2 脂多糖与凝集素抑制剂联合作用对凡纳滨对虾血细胞凝集活性和酚氧化酶原系统的影响
• 5 结论
• 参考文献