水稻条纹病毒浙江分离物的研究

论文摘要

近年来，水稻条纹叶枯病在我国水稻种植区大范围发生，尤以东部的江苏、浙江两省损失最为严重。本研究采集了浙江省7个市／县的水稻条纹病毒显症病样，经酶联免疫吸附检测（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、SDS-PAGE电泳、电子显微镜技术和RT-PCR技术鉴定，结果证明这7个分离物都与RSV江苏分离物在血清学上有近源关系（RSV-Js）。在电子显微镜下，病毒粒子的形状为3-10 nm宽、500-2000 nm长且极度卷曲的柔丝体，在低浓度和合适缓冲液环境下可展开。经SDS-PAGE电泳可见大小为35.5±0.5 kDa的蛋白带，系RSV核衣壳蛋白（核蛋白质或外壳蛋白）。同时，用纯化的RSV病毒免疫小鼠和家兔，制备了高特异性的抗血清，利用这些抗血清设计了双抗体夹心酶联免疫吸附检测RSV的试验方法。根据已知的RSV碱基序列，在大肠杆菌中表达了RSV浙江分离物的核衣壳蛋白；并利用RT-PCR技术成功克隆了RSV浙江分离物RNA1基因组，测定了整个RNA1全序列。RSV浙江分离物RNA1全序列包含8968个核苷（nt），且基因组结构与其他RSV分离物相似。RSV-Zj的RNA1也只包含了一个大的开放阅读体框（ORF），能编码一个含2919个氨基的酸pc1蛋白质，分子量大小预计为337kDa。序列分析表明它与其它4个分离物RNA1的结构相似，核苷酸同源性为92-97％，氨基酸同源性为97-99％；与同属的其它成员的对应蛋白相比，则同源性则较低，约在30-46％之间。结构域分析表明RSV pc1是蛋白酶家族的一个多蛋白（polyprotein）成员，它在表达后很可能通过自降解过程产生病毒RNA聚合酶和其它病毒蛋白质。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述:水稻条纹病毒研究的历史和现状
• 1.1 水稻条纹病的症状
• 1.2 RSV的传播特性及其寄主范围
• 1.3 RSV的分类学
• 1.4 RSV粒子
• 1.5 RSV基因组
• 1.6 RSV蛋白
• 1.7 本研究的意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 试剂
• 2.2 仪器
• 2.3 病毒材料
• 2.4 菌株和质粒
• 2.5 细菌培养
• 2.6 质粒的少量提纯（碱裂解法）
• 2.6.1 试剂
• 2.6.2 步骤
• 2.7 用试剂盒纯化核酸
• 2.8 RT-PCR
• 2.8.1 cDNA合成
• 2.8.2 PCR扩增目的基因
• 2.8.3 PCR产物的切胶纯化
• 2.9 DNA片段与载体的连接反应
• 2.9.1 克隆载体构建
• 2.9.2 酶切与回收目的基因
• 2.9.3 表达载体构建
• 2.10 感受态细胞制备及转化
• 2:法）'>2.10.1 感受态细胞的制备（CaCl₂:法）
• 2.10.2 转化和筛选
• 2.11 核酸序列测定及分析
• 2.12 RSV提取方法
• 2.13 电子显微镜技术
• 2.14 抗血清制备
• 2.15 ELISA
• 2.15.1 试剂
• 2.15.2 步骤
• 2.16 从病叶或纯化的病毒中提取基因组
• 2.17 IPTG诱导表达
• 2.18 电泳
• 2.18.1 琼脂糖凝胶电泳
• 2.18.2 SDS-PAGE
• 2.18.2.1 凝胶成分（表1）
• 2.18.2.2 上样与电泳
• 2.18.2.3 染色与脱色
• 2.18.2.4 试剂:
• 2.19 Western blot
• 2.19.1 电泳与转膜
• 2.19.2 封闭并与一抗反应
• 2.19.3 与二抗反应
• 2.20 灰飞虱饲养
• 第三章 浙江水稻条纹病的病原鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 病原材料
• 3.2.3 病毒提取
• 3.2.4 电子显微镜观察
• 3.2.5 ELISA
• 3.2.6 总RNA提取
• 3.2.7 RT-PCR检测
• 3.2.8 琼脂糖凝胶电泳
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 ELISA试验
• 3.3.2 病毒粒子形态
• 3.3.3 病毒粒子的组成
• 3.3.4 RT-PCR鉴定
• 第四章 水稻条纹病毒浙江分离物抗血清制备及应用
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 病原材料
• 4.2.3 试验动物
• 4.2.4 菌株及载体
• 4.2.5 病毒提取
• 4.2.6 RSV外壳蛋白的原核表达
• 4.2.7 抗血清的制备
• 4.2.8 ELISA
• 4.2.9 SDS-PAGE和Western Blot
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RSV抗血清制备及其效价测定
• 4.3.2 间接ELISA分析兔血清和鼠血清的灵敏度
• 4.3.3 兔血清和鼠血清的特异性分析
• 4.3.4 双抗夹心ELISA法及其灵敏度分析
• 4.3.5 双抗夹心ELISA法检测病株和单头灰飞虱的带毒情况
• 4.3.6 原核表达的外壳蛋白检测
• 第五章 水稻条纹病毒浙江分离物基因组片断RNA1的克隆及序列分析
• 5.1 引言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 病毒分离物及其基因组RNA提纯
• 5.2.2 RT-PCR扩增基因组片断RNA1序列
• 5.2.3 扩增产物的克隆和测序
• 5.2.4 序列分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 RNA1克隆及其序列
• 5.3.2 pc1蛋白的RNA聚合酶结构域
• 5.3.3 RSV-ZJ pc1蛋白的OTU结构域
• 5.3.4 RSV进化分析
• 第六章: 主要结论与进一步研究的建议
• 6.1 全文小结
• 6.2 进一步研究建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录一: 图表目录
• 附录二: 硕士期间形成的主要论文