论文摘要
急性肝功能衰竭（acute liver failure ALF）是临床急危重征之一,病情危重,进展迅速,预后凶险,尽管近年来内科综合治疗措施取得了较大进展,患者病死率依然高达80%,是临床亟待解决的难题。目前,唯一有效的治疗是原位肝移植,然而,供体的日益短缺、围手术期成本高和手术复杂,使得绝大多数患者得不到最有效的治疗。基于此种前提下,国内外学者设计、构建了不同类型的人工肝系统,希冀借助一种体外的机械、理化或者生物的装置,清除患者体内蓄积的各种有害物质,补充必需物质,改善内环境,暂时替代衰竭肝脏的部分功能,为肝脏再生创造条件,作为通向肝移植的桥梁,从而降低患者病亡率。经过50余年的发展,目前人工肝治疗技术已逐渐成熟,其发展过程中先后经历了人-动物血液透析、体外离体肝灌注、人-人交叉循环、游离肝细胞移植到肝细胞悬液透析、混合型型生物人工肝支持系统等。其中,混合型生物人工肝（hybrid bioartificial liver, HBAL）代表着人工肝的发展方向。肝细胞作为HBAL的其核心原材料,对肝功能衰竭患者的肝支持作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。肝细胞来源种类较多,但目前尚未有一种可以完全满足临床的需要,如人肝细胞来源的匾乏、胎肝细胞的伦理问题、肝细胞株的瘤源性等原因、猪肝细胞潜在的异种细胞免疫反应、合成的蛋白质种属差异和猪体内普遍存在着内源性反转录病毒（procine endogenous retroviral,PERV）。我们的前期研究发现,中国人肝细胞系1细胞（CL-1 Cells）分化程度高且生物代谢功能良好,并且CL-1细胞组织学上来源于正常肝组织,较其他来源于肿瘤源性的肝细胞系更为安全,但是目前尚未对CL-1细胞作为种子细胞的HBAL进行研究。HBAL的另一核心则是生物反应器。理想的生物反应器应能为肝细胞提供较好的生长代谢环境,并达到较好的物质交换目的。我研究所与中国科学院电工研究所共同研制了一种全接触灌流型生物反应器,其采用双进口和双出口的透明有机塑料制成,进行治疗时能做180度的往返旋转运动,生物反应器中的肝细胞与血浆直接接触,可以充分的发挥肝细胞的代谢和生物转化功能,并且生物反应器有独立的供给氧气的装置,氧气通过膜式氧合器进入血清中,供给反应器中的肝细胞,以保证生物反应器中的肝细胞得到充分的氧气供应。本研究中,我们以这种全接触灌流型生物反应器接种微载体微重力CL-1细胞,结合非生物部分的膜型血浆分离器、血浆灌流器、蠕动泵等构建了一种简单、新颖的人源细胞混合型生物人工肝,并用食蟹猴急性肝功能衰竭模型对其进行安全性及有效性评价。具体包括以下两部分研究内容：一：食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立；二：新型人源细胞混合型生物人工肝的安全性及有效性评价。第一部分食蟹猴急性肝功能衰竭模型的建立目的构建一种稳定的具有潜在可逆性和良好重复性的非人灵长类大动物急性肝衰竭模型,为下一步开展新型人源细胞混合型生物人工肝的安全性与有效性评价奠定基础。方法选取雄性食蟹猴作为模型动物。15只食蟹猴随机分为3组：第一组为高剂量组（n=5）,给药剂量为0.45g/kg；第二组为中等剂量组（n=5）,给药剂量为0.3g/kg；第三组为低剂量组（n=5）,给予D-氨基半乳糖0.15g/kg。在速眠新Ⅱ和氯胺酮复合麻醉下把D—氨基半乳糖溶液经颈外静脉注入食蟹猴体内。给药后动态观察肝功能、肾功能、血糖、血氨、凝血项、支链氨基酸和芳香族氨基酸比等,记录动物存活时间。死亡动物立即尸检,动物死后作详细尸检并取肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、胃肠和脑组织标本,光镜及电镜下观察上述组织的病理学变化。统计学方法：采用SPSS13.0统计学软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（X±S）表示,各指标采用重复测量方差分析,生存时间采用Kaplan-Meier法。P≤0.05,有显著性差异或差异有统计学意义。结果高剂量组的平均存活时间是（56.1±8.1）h,有4/5的病食蟹猴死亡前出现肝昏迷,不能站立。中剂量组的平均存活时间为（109.8±11.2）h,其中3/5的病食蟹猴出现肝昏迷。低剂量组以剂量为0.15g/kg D-氨基半乳糖胺引导的5只食蟹猴中,除1只98h后死亡外其余全部存活,在第4d开始好转,之后全部指标渐恢复正常。中剂量组两只食蟹猴的存活时间分别为105和120 h,血清的转氨酶在给药后12 h开始升高,并随病程进展越来越高,血中的胆红素、胆酸、氨、乳酸也逐渐上升。而血小板则越来越低,凝血酶原时间越来越长。所有实验食蟹猴的血液电解质和酸碱度一直保持在正常的范围内。血气分析的结果也在正常范围,没有明显的变化。直线相关分析显示注射D-gal的动物存活时间与D-gal剂量呈显著负相关。Kaplan-Meier生存分析表明各组实验猴生存时间比较,（X2=21.933,P<0.001）差异有显著性。尸检发现所有给予D-gal的动物肝脏体积缩小,边缘变锐,表面色泽斑驳,散在针尖至米粒大小出血点,肝脏切面有暗红色淤血,黄色乳靡状坏死物质溢出,胆囊形态、大小正常,肠管有轻度到中度胀气,肠壁充血水肿,有散在出血点,肾脏、脾脏、肺脏肉眼未见异常。脑组织重度水肿,以血管周围间隙与星状细胞周围明显。光镜检查发现对照组动物肝小叶结构完整,无肝细胞坏死征象。而注射D-gal的动物均出现肝细胞片状坏死,伴有明显的出血,肝细胞弥漫性肿胀,肝窦受压变窄。肝细胞胞浆疏松化、空泡变性,部分肝细胞内可见脂肪空泡。部分肝细胞核碎裂、溶解。部分汇管区可见中性粒细胞和淋巴细胞浸润。高剂量组的动物肝细胞呈现大片坏死,肝小叶结构不清,出血严重。电镜检查未注射D-氨基半乳糖胺时,肝脏超微结构示食蟹猴肝细胞胞浆内糖原颗粒丰富,内质网丰富无扩张,线粒体丰富无肿胀,嵴清晰,线粒体膜清楚,细胞核染色质均匀,核膜核仁清晰。注射D-氨基半乳糖胺时,细胞浆内糖原颗粒均质化,粗面内质网脱颗粒,线粒体肿胀,嵴模糊,部分线粒体溶解,细胞间毛细胆管微绒毛减少明显,细胞核染色质集聚,核变形,核内假包涵体形成。结论1.成功建立了D-gal诱导的ALF模型及摸索出最佳药物剂量；2. D-gal诱导的食蟹猴ALF模型具有与人类ALF相似的临床、生化和病理学特征。3. D-gal诱导的食蟹猴ALF模型具有潜在可逆性和良好的重复性,动物死于ALF,且具有合适的治疗时间“窗口”,适合应用于人工肝临床前评价研究。第二部分新型人源细胞混合型生物人工肝安全性与有效性评价目的本研究旨在设计一种新型人源细胞混合型生物人工肝,并通过对食蟹猴急性肝功能衰竭的救治评价其安全性与有效性,探讨其临床应用的可行性。材料和方法整个HBAL的设计采用血浆灌流+生物人工肝模式,非生物部分通过血浆分离后进入血液灌流器中,经过灌流后的血液在通过蠕动泵部分进入生物反应器中,生物反应器部分置于37.5℃的恒温环境中,生物部分通过膜式氧合器供给反应器中肝细胞,氧气和二氧化碳气体时间比约为110：10（即2分钟内通氧气110s,通二氧化碳10s）,食蟹猴肝衰竭血浆经过肝细胞代谢后,再通过二次分浆回流至非生物部分,整个系统的预冲量约为800ml.其中灌流型生物反应器的预冲量约为300ml,整个系统通过旭化成血液净化用血液回路和自制聚乙烯胶管构成一个封闭的环路。选用中国人肝细胞系1（CL-1）作为肝细胞供体,采用微载体微重力肝细胞共培养方法培养至第五天,灌入反应器中,制成生物部分（细胞总量约为2.0×109,细胞密度4.0×108/ml）。选取雄性食蟹猴（体质量6.5～7kg）作为模型动物,采用D-gal 0.3g/kg颈外静脉注射法,诱发食蟹猴ALF模型。注射D-gal 48h后,15只ALF食蟹猴随机分成2组,即（1）ALF对照组（n=5）：食蟹猴仅予水与食物,未给予任何治疗措施；（2） HBAL治疗组（n=10）：动物接受HBAL治疗6h,生物反应器内接种2.0×109 CL-1细胞。观察治疗期间循环管路密闭性,以及治疗过程中不良反应情况和混合型生物人工肝治疗前、治疗中及治疗后观察食蟹猴生命体征变化；记录动物生存时间,动态检测天冬氨酸转氨酶、白蛋白、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨及计算Fischer指数等；食蟹猴死亡后立即作详细尸检并取肝脏、肾脏、脾脏、胰腺、心脏、肺、胃肠和脑组织标本,光镜及电镜下观察上述组织的病理学变化。此外,于HBAL治疗开始前及结束后取样计数反应器中肝细胞数量和肝细胞的状态,MTT法检测肝细胞活性。治疗结束后,取二次分浆后培养液镜检,同时取生物反应器中的CL-1细胞,以2.5g/L胰蛋白酶消化后离心,加DMEM调至细胞密度为1.0×1010/L,-70℃反复冻溶三次,使细胞裂解,将0.2ml含细胞碎片的溶液分别接种到5只裸鼠的颈部、后背部皮下（n=10）)。以0.2ml,密度为1.0×1010/L的CL-1细胞接种到5只裸鼠的颈部、后背部皮下（n=10）,苔盼蓝拒染试验计数活细胞率为97%,作对照,观察皮下细胞致瘤情况。4周后切取注射部位瘤组织及肝、肺、脑组织标本,苏木精-伊红（HE）染色镜检,观察细胞形态、排列及细胞核染色及是否有侵犯周边组织等情况。统计学方法：计量资料采用均数±标准差X±S表示。计量资料组间比较采用t检验及重复测量数据的方差分析,组间生存率的比较采用X2检验。动物存活时间采用Kaplan-Meier （KM）法生存分析及Log-Rank检验。所有资料的分析均采用SPSS 13.0 for Windows统计软件。P≤0.05,有显著性差异或差异有统计学意义。结果10只进行救治的急性肝衰竭食蟹猴无一于治疗过程中死亡。整个治疗过程中未发现循环管路中有液体渗漏,未发生明显的出血、过敏、高热及其他严重的不良反应,耐受良好。生命体征监测方面,除开始引血时出现一过性心率和血压波动,治疗全程心率、血氧饱和度、呼吸及平均动脉压都能保持稳定。治疗结束后,HBAL治疗组食蟹猴保持清醒,此后5只食蟹猴逐渐出现乏力、活动减少、反应迟钝、嗜睡、昏迷,并于注射D-gal 108-123h后死亡。但与ALF对照组比较,HBAL治疗组食蟹猴无出现呕吐、抽搐等严重消化道及神经系统症状。HBAL治疗组中5只食蟹猴存活,其余5只死亡,存活时间为128±3；ALF对照组食蟹猴全部死亡,存活时间为112±2。Kaplan-Meier （KM）法生存分析提示HBAL治疗可显著延长受试动物的生存时间（p<0.01）注射D-gal 48h后,全部食蟹猴均出现血清天冬氨酸转氨酶、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨浓度急剧升高,白蛋白、Fischer指数显著降低。HBAL治疗后,HBAL治疗组血清天冬氨酸转氨酶、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨浓度明显较ALF对照组降低。HBAL治疗开始前CL-1细胞活度为97-99%,治疗结束后,结束后CL-1细胞活度可保持为85-90%。二次分浆后取培养液镜下未见CL-1细胞。CL-1细胞接种至裸鼠的颈部、后背部皮下后4周时,实验组未见接种部位出现种植瘤,对照组共有10个接种部位出现肿瘤,致瘤率为100%。瘤体呈光滑的圆球型,界限清楚,有完整的包膜,肝、肺、脑等组织器官中未发现转移瘤。结论：1.构建了一种新型灌流型生物反应器。该生物反应器中的CL-1细胞能够保持较高的活性和良好的功能,同时CL-1细胞可以安全的作为HBAL细胞材料。2.构建了一种新型混合生物型人工肝。该型人工肝可以显著降低受试动物血清中天冬氨酸转氨酶、总胆红素、总胆汁酸、尿素氮、肌酐、血氨浓度,改盖Fischer指数,并延长动物存活时间,提示其具有明显的肝支持作用。
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