蜘蛛香提取物体外抗结肠癌作用研究

论文摘要

目的：研究败酱科（Valerianaceae）缬草属（Valeriana Linn）植物蜘蛛香（Valeriana jatamansi Jones）提取物对人结肠癌SW480细胞的增殖抑制和抗转移作用。方法：以总黄酮为指标,通过正交法筛选蜘蛛香超声提取的最佳工艺,通过大孔吸附树脂纯化除杂得到所需蜘蛛香提取物。采用紫外分光光度法测定蜘蛛香提取物中总黄酮的含量,采用HPLC测定其橙皮苷、槲皮素、芹菜素的含量。通过MTT法、细胞脱落实验、病理观察、流式细胞仪检测观察蜘蛛香提取物和橙皮苷、芹菜素对结肠癌SW480细胞的增殖抑制、促进凋亡等作用；通过划痕实验、同质性粘附实验观察其抗结肠癌SW480细胞转移作用。结果：以总黄酮为指标,经正交实验筛选,确定蜘蛛香超声提取最佳工艺为65%乙醇、20倍量提取20分钟、提取3次。采用紫外分光光度法进行样品总黄酮含量测定,计算得蜘蛛香中总黄酮含量为2.27%,经大孔吸附树脂处理后浸膏中总黄酮含量为3.47%。采用高效液相色谱法测定样品中橙皮苷、槲皮素和芹菜素含量,计算得蜘蛛香中橙皮苷含量为0.34%,槲皮素含量较低,无法测出,芹菜素含量为0.0009%；经大孔吸附树脂处理后样品中橙皮苷含量为2.99%,槲皮素含量为0.04%,芹菜素含量为0.05%。应用MTT法检测蜘蛛香大孔树脂提取物、橙皮苷、芹菜素和5-氟尿嘧啶（5-FU）对人结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用,实验结果表明：在作用24h后,各组药物在实验剂量下均能有效抑制SW480细胞的增殖,蜘蛛香提取物组、橙皮苷组、芹菜素组与5-FU组比较无显著性差异。细胞脱落实验进一步表明,与空白对照组相比,各药物组均能增强细胞的脱落率,抑制细胞的增殖,具有极显著性差异（P<0.01）。流式细胞仪检测结果显示,各药物组给药24h后,与空白对照组相比,均能显著提高肿瘤细胞的凋亡率（P<0.01）；且蜘蛛香提取物组和橙皮苷组G0/G1期细胞数明显降低,而S期和G2/M期细胞百分比与空白对照组相比均有明显增加。病理观察显示,光镜下各组细胞均表现出肿瘤细胞的特征,如细胞形状不规则、核大、核浆比例大、多核仁等。其中空白对照组少见有凋亡形态的细胞出现,而各用药组均可见有细胞凋亡的典型形态学变化出现,如细胞体积缩小、变圆,细胞膜完整,细胞核固缩、染色质凝聚深染。划痕实验表明,蜘蛛香提取物和芹菜素均能显著降低结肠癌SW480细胞的移动能力（P<0.05）,其中芹菜素的效果最强。对SW480细胞同质性粘附率的影响,各组药物之间没有明显差异。结论：经正交实验筛选,蜘蛛香超声提取最佳工艺为65%乙醇、20倍量提取20分钟、提取3次。进一步经大孔吸附树脂纯化除杂得到的蜘蛛香提取物中,总黄酮、橙皮苷、芹菜素和槲皮素的含量显著增加,含量分别为3.47%、2.99%、0.04%和0.05%。蜘蛛香提取物和橙皮苷、芹菜素能够显著抑制结肠癌SW480细胞的增殖,促进细胞凋亡,阻滞细胞于S期和G2M期,对其移动能力也有明显的影响,表明物蜘蛛香提取物及其有效成分对人结肠癌SW480细胞有明显的增殖抑制和抗转移作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 课题来源
• 1.2 本课题的特色与创新
• 1.2.1 工艺创新
• 1.2.2 应用创新
• 1.3 结肠癌研究进展
• 1.3.1 结肠癌概述
• 1.3.2 结肠癌的手术治疗
• 1.3.3 结肠癌常用化疗药物
• 1.3.4 结肠癌中药治疗进展
• 1.4 蜘蛛香研究进展
• 1.4.1. 生药学研究
• 1.4.2. 化学成分研究
• 1.4.3. 药理活性
• 1.5 黄酮类成分抗肿瘤及其机制研究
• 1.5.1 抗细胞增殖的作用
• 1.5.2 干预细胞信号转导
• 1.5.3 黄酮类化合物诱导细胞凋亡
• 1.5.4 黄酮类化合物促进抑癌基因表达
• 第2章 蜘蛛香黄酮类成分提取及含量测定
• 2.1 主要仪器及试剂
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要药物试剂
• 2.2 蜘蛛香黄酮类成分的提取
• 2.2.1 脱脂处理
• 2.2.2 正交实验
• 2.2.3 验证实验
• 2.3 紫外分光光度法测定总黄酮含量
• 2.3.1 对照品和样品溶液的制备
• 2.3.2 测定波长的选择
• 2.3.3 线性关系考察
• 2.3.4 精密度
• 2.3.5 重复性
• 2.3.6 稳定性
• 2.3.7 加样回收率
• 2.3.8 含量测定
• 2.4 HPLC测定橙皮苷含量
• 2.4.1 色谱条件
• 2.4.2 对照品和样品溶液的制备
• 2.4.3 标准曲线的制作
• 2.4.5 仪器精密度实验
• 2.4.6 稳定性实验
• 2.4.7 样品含量测定
• 2.5 HPLC测定芹菜素和槲皮素含量
• 2.5.1 色谱条件
• 2.5.2 对照品和样品溶液的制备
• 2.5.3 标准曲线的制作
• 2.5.4 仪器精密度实验
• 2.5.5 稳定性实验
• 2.5.6 样品含量测定
• 2.6 小结
• 第3章 蜘蛛香提取物抗人结肠癌SW480细胞作用研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 主要设备
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 细胞培养
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验药物及分组
• 3.2.2 MTT法检测细胞增殖
• 3.2.3 细胞脱落实验
• 3.2.4 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡
• 3.2.5 病理学观察
• 3.2.6 划痕实验
• 3.2.7 同质性粘附实验
• 3.2.8 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 抑制细胞增殖
• 3.3.2 细胞脱落实验
• 3.3.3 对细胞凋亡和细胞周期的作用
• 3.3.4 病理学观察
• 3.3.5 划痕实验
• 3.3.6 同质性粘附实验
• 3.4 小结
• 结论
• 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的论文及参加的科研课题