RACK1蛋白在毕赤酵母中的表达及其在调控拟南芥气孔运动中的作用

论文摘要

活化态C激酶1受体（Receptor for Activated C Kinase 1, RACK1）是一种WD40重复蛋白。哺乳动物中,RACK1被认为是一种支架蛋白,它能与许多重要的信号分子相互作用,在细胞信号转导中具有重要的作用。许多研究表明,植物细胞中存在与哺乳动物RACK1高度同源的蛋白质,并可能参与了植物对激素、干旱胁迫的响应过程及细胞分裂与生长发育的调控。气孔保卫细胞是研究高等植物细胞信号转导的模式系统。保卫细胞气孔运动中存在着复杂的信号转导网络,如ABA、G蛋白、NO的信号转导途径等。研究气孔运动信号转导途径及其调控机制对于认识植物整体对环境的适应机制具有重要的科学意义。本实验首先利用真核毕赤酵母表达系统成功将AtRACK1/OsRACK1基因整合到毕赤酵母GS115的染色体上,通过甲醇诱导分别使拟南芥RACK1和水稻RACK1蛋白得到了有效分泌和表达,为进一步获得植物RACK1蛋白抗体奠定基础。在此基础上,还以野生型Col、WT以及gpa1-4、agb1-2、rack1a-1、athk1、atnos1、αβ36、rack1a-1gpa1-4,rack1a-1agb1-2、athk1rack1a-1突变体为研究材料探讨了G蛋白、RACK1蛋白、AtHK1蛋白在ABA诱导NO合成及RACK1蛋白在ABA、NO调控气孔运动中的作用,并比较了十一种基因型在气孔密度及气孔显微结构上的差异,主要研究结果总结如下:（1）ABA能够诱导野生型拟南芥保卫细胞合成NO。GPA1、AGB1蛋白通过不同的调控机制调节组成型及诱导型NO的生成,GPA1、AGB1蛋白在ABA诱导的保卫细胞NO生成过程中起正调控作用。RACK1蛋白可能参与了ABA诱导的保卫细胞NO生成过程,并起正调控作用。研究还表明,ABA诱导的保卫细胞NO生成过程需要NOS及AtHK1蛋白的参与。（2）ABA和NO能够诱导拟南芥野生型气孔关闭。GPA1、AGB1、RACK1不一定是ABA诱导气孔关闭信号转导途径所必需的。在NO介导的气孔关闭过程中,G蛋白α、β亚基中任意一者缺失均不起作用,只有两者共同存在时才能起调控作用。RACK1蛋白不参与NO促进气孔关闭的信号转导过程。（3）ABA和NO均能抑制气孔开放。ABA抑制气孔开张的信号转导途径需要GPA1蛋白的参与,RACK1、AtHK1蛋白在该途径中不起主要的调控作用。GPA1、AGB1、RACK1并不参与NO抑制气孔开放过程。（4）rack1a-1、rack1a-1agb1-2、rack1a-1gpa1-4等突变体叶片的气孔密度均显著小于野生型Col,athk1、athk1rack1a-1的气孔密度均显著大于野生型WT,推测气孔的发育涉及多种蛋白的调控,rack1a-1、rack1a-1agb1-2、rack1a-1gpa1-4可能主要通过减小气孔孔径及气孔密度来降低干旱胁迫下的蒸腾作用,减少水分的损失。（5）拟南芥各基因型的保卫细胞呈对称排列,使气孔器呈椭圆形或卵圆形。Col、WT、athk1rack1a-1保卫细胞外拱盖表面平滑;gpa1-4、agb1-2、rack1a-1气孔周壁上有明显的波状嵴;agb1-2、αβ36、athk1、atnos1的少数气孔外壁略有突起;rack1a-1gpa1-4、rack1a-1agb1-2保卫细胞外壁明显隆起,呈瘤状突起。气孔外壁突起的特征可能与agb1-2、rack1a-1gpa1-4、rack1a-1agb1-2的耐旱性相关。根据以上研究结果,我们推测RACK1参与了ABA诱导的保卫细胞内NO合成过程,但在ABA诱导气孔关闭及抑制气孔开放过程中不起主要的调控作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• Abbreviations
• 第一章 文献综述
• 1.1 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统简介
• 1.1.1 巴斯德毕赤酵母的生物学特点
• 1.1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点
• 1.1.3 宿主菌株
• 1.1.4 表达载体
• 1.1.5 表达载体与酵母的整合
• 1.1.5.1 单一交叉插入
• 1.1.5.2 双重交叉替换
• 1.1.6 巴斯德毕赤酵母的应用前景
• 1.2 RACK1 蛋白研究进展
• 1.2.1 RACK1 是WD40 重复蛋白
• 1.2.2 动物RACK1 蛋白是一个支架蛋白
• 1.2.3 植物中的RACK1 蛋白
• 1.2.4 植物中RACK1 的生理功能
• 1.3 植物异三聚体G 蛋白研究进展
• 1.3.1 G 蛋白概述
• 1.3.2 植物异三聚体G 蛋白信号组分
• 1.3.2.1 异三聚体G 蛋白
• 1.3.2.2 G 蛋白偶联受体
• 1.3.2.3 G 蛋白信号调节蛋白（RGS）
• 1.3.2.4 G 蛋白偶联的下游效应器
• 1.3.2.5 异三聚体G 蛋白偶联信号途径
• 1.4 AtHK1 蛋白
• 1.5 植物一氧化氮（NO）研究进展
• 1.5.1 NO 的生物合成
• 1.5.1.1 NOS 催化产生NO
• 1.5.1.2 NR/NiR 催化产生NO
• 1.5.1.3 非酶促反应产生NO
• 1.5.2 NO 的生理功能
• 1.6 保卫细胞中ABA、G 蛋白、NO 信号转导途径
• 1.6.1 气孔运动调控
• 1.6.2 保卫细胞中 ABA 信号转导途径
• 2+信号的途径'>1.6.2.1 依赖于 Ca²⁺信号的途径
• 2+信号的途径'>1.6.2.2 不依赖于Ca²⁺信号的途径
• 1.6.3 保卫细胞中G 蛋白信号转导途径
• 1.6.4 保卫细胞中NO 信号转导途径
• 1.7 研究目的及研究内容
• 第二章 AtRACK1 及 OsRACK1 基因在毕赤酵母 GS115 中的表达研究
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 菌株与质粒
• 2.2.1.2 酶与试剂
• 2.2.1.3 培养基
• 2.2.1.4 储备液
• 2.2.1.5 试剂与缓冲液
• 2.2.1.5.1 酵母总DNA 抽提液
• 2.2.1.5.2 SDS-PAGE 电泳试剂
• 2.2.1.6 常用储液
• 2.2.1.7 主要试验仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 pMD 18-T simple-AtRACK1/OsRACK1 质粒的构建
• 2.2.2.1.1 pMD 18-T-OsRACK1、pCup-NuI-MCS-CYC1-AtRACK1 质粒的抽提
• 2.2.2.1.2 引物设计与PCR 扩增
• 2.2.2.1.3 凝胶回收PCR 产物
• 2.2.2.1.4 目的基因连接到pMD 18-T simple vector
• 2.2.2.1.5 大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.2.1.6 大肠杆菌（E.coli）DH5α的转化
• 2.2.2.1.7 AtRACK1/OsRACK1 基因的PCR 检测
• 2.2.2.2 重组质粒pPIC9K-AtRACK1 及pPIC9-OsRACK1 的构建
• 2.2.2.2.1 pMD 18-T simple-AtRACK1/OsRACK1 和 pPIC9K/pPIC9 的抽提
• 2.2.2.2.2 pMD 18-T simple-AtRACK1/OsRACK1 和 pPIC9K/pPIC9 分别双酶切及纯化回收
• 2.2.2.2.3 表达载体pPIC9K-AtRACK1 及pPIC9-OsRACK1 的构建
• 2.2.2.3 毕赤酵母GS115 感受态细胞的制备及转化
• 2.2.2.3.1 毕赤酵母 GS115 感受态细胞的制备
• 2.2.2.3.2 线性化重组质粒pPIC9K-AtRACK1 及pPIC9-OsRACK1
• 2.2.2.3.3 毕赤酵母的电转化
• 2.2.2.3.4 表达菌株的PCR 检测确定
• 2.2.2.3.4.1 毕赤酵母基因组的提取
• 2.2.2.3.4.2 AtRACK1/OsRACK1 基因的PCR 检测
• 2.2.2.4 AtRACK1/OsRACK1 基因在毕赤酵母中的诱导表达
• 2.2.2.5 SDS-PAGE 凝胶的制备及发酵上清液的SDS-PAGE 电泳分析
• 2.2.2.5.1 SDS-PAGE 凝胶的制备
• 2.2.2.5.2 SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 AtRACK1/OsRACK1 基因的PCR 扩增
• 2.3.2 AtRACK1/OsRACK1 基因在pMD 18-T simple vector 上的克隆
• 2.3.3 重组质粒pPIC9K-AtRACK1 及pPIC9-OsRACK1 的构建及鉴定
• 2.3.4 酵母的电转化及重组子的筛选
• 2.3.4.1 重组质粒pPIC9K-AtRACK1 及pPIC9-OsRACK1 的线性化
• 2.3.4.2 重组子的筛选
• 2.3.4.2.1 酵母菌总DNA 的提取
• 2.3.4.2.2 重组酵母总DNA 中的AtRACK1/OsRACK1 基因 PCR 检测
• 2.3.5 AtRACK1/OsRACK1 蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3.5.1 重组菌的光学显微镜检测
• 2.3.5.2 SDS-PAGE 电泳分析
• 2.4 小结
• 2.5 讨论
• 第三章 拟南芥 RACK1 蛋白在 ABA 诱导保卫细胞中 NO 生成及在ABA 调控气孔运动中的作用
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 药品和试剂
• 3.2.3 实验方法
• 3.2.3.1 植物栽培
• 3.2.3.2 NO 荧光探针的装载
• 3.2.3.3 荧光显微镜记录保卫细胞内NO 的变化
• 3.2.3.4 气孔关闭的生物分析
• 3.2.3.5 气孔开放的生物分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 拟南芥各基因型保卫细胞内NO 荧光的变化
• 3.3.2 ABA、SNP 对拟南芥各基因型气孔关闭的影响
• 3.3.3 ABA、SNP 对拟南芥各基因型气孔开放的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 拟南芥各基因型气孔密度的比较及气孔显微观察
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 气孔密度试验
• 4.2.2.2 气孔形态观察
• 4.3 实验仪器
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 各基因型的叶片形态
• 4.4.2 各基因型的气孔密度
• 4.4.3 各基因型的气孔形态
• 4.5 讨论
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢