论文摘要
家蚕（Bombyx mori）是重要的经济昆虫,也是鳞翅目昆虫的典型代表。许多研究表明雄蚕具有生命力强、食桑少、茧丝净度好、生丝品级高、生丝产量可提高20%等优点。因此,研究家蚕的性别决定机制,通过人为控制家蚕性别最终实现单养雄蚕可以有效地提高蚕业生产效率和经济效益;同时鳞翅目昆虫是主要的农林害虫,探明家蚕的性别决定机制,还有助于开展防治农林害虫的研究。Sxl基因在模式昆虫果蝇的体细胞性别决定网路中是关键的开关基因,它调控着果蝇体细胞性别决定、剂量补偿和种系分化。而在家蝇（Musca domestica）、地中海实蝇（Ceratits capitata）等非果蝇属种中,Sxl在两性中主要或唯一的功能是作为转译抑制因子来调节基因的活性,目前并无证据表明这些物种中的Sxl基因与其性别决定相关。针对家蚕BmSxl基因的研究结果相对较少。2006年Teruyuki Niimi等在家蚕早期胚胎中找到BmSxl两种剪切形式的转录本（Bm-Sxl-L和Bm-Sxl-S）并将其定位在16号染色体上,同年查幸福在家蚕五龄幼虫中发现BmSxl转录表达的两种剪切体（BmSxl-PA和BmSxl-PB）。分析这两种来源于家蚕不同发育时期的BmSxl转录本发现,BmSxl-PA和Bm-Sxl-L的差异极小,而BmSxLPB和Bm-Sxl-S剪接形式相差较大。本研究基于家蚕基因组精细图、家蚕组织芯片数据和重组杆状病毒真核表达体系对家蚕BmSxl基因进行了全长cDNA克隆、雌雄体表达谱的鉴定和BmSxl-PB剪接体蛋白的真核表达,对BmSxl基因的功能进行了初步的探讨。获得的主要研究结果如下:1.成功克隆获得了家蚕BmSxl基因（-PB）剪接形式的全长序列通过对Sxl基因（BmSxl-PA/-PB）设计引物,以5龄3d幼虫精巢总RNA样品为模板,采用RT-PCR的方法克隆获得了Sxl基因的BmSxl-PB序列。BmSxl-PB剪接形式的开放阅读框序列为939bp,编码313个氨基酸,和BmSxl-PA形式相比缺失了第8外显子的一部分,是一种截短的形式。2.对家蚕BmSxl基因的生物信息学分析对家蚕BmSXL剪切体蛋白和不同昆虫SXL蛋白进行了多序列比对和进化分析,结果显示:（1）Bm-Sxl-L与BmSxl-PA基本相同,为BmSxl基因相似的剪切表达形式,而Bm-Sxl-S与BmSxl-PB不相同,为BmSxl基因在家蚕胚胎早期和幼虫期不同的剪切表达形式;（2）家蚕和果蝇的Sxl基因剪切表达的差异在N端和C端的变异和不同的外显子转录拼接位点;（3）在通过邻近结合法构建的系统进化树中,家蚕BmSxl基因与其他20种昆虫的Sxl基因序列在进化亲缘关系上可以初步分为5个分支。3.家蚕BmSxl基因表达谱通过对家蚕BmSxl基因两种剪切体在整个幼虫期和变态发育期剪切表达的RT-PCR的检测和芯片数据分析,初步发现:（1）BmSxl-PA剪切体在雌雄虫体所有组织呈遍在性地高活性表达:（2）BmSxl-PB剪切体只在幼虫期5龄3d的精巢呈高活性表达和在上簇24h～96h活性上调:（3）雌雄体细胞和生殖腺的发育除需要BmSxl-PA的高活性表达外,雄生殖腺的发育还需要BmSxl-PB在5龄3d和上簇24h～96h这一关键时期的表达。4.家蚕BmSxl-PB剪接体的真核表达家蚕通过构建重组转座载体pFastBac-Sxl-PB,借助转化到大肠杆菌DH10Bac细胞内的辅助质粒的转座酶功能,将BmSxl-PB剪切体转座到细胞内杆状病毒穿梭载体Bacmid中,构建成“重组Bacmid-Sxl-PB杆粒”,通过转染sf9细胞筛选获得重组Bacmid-Sxl-PB杆粒病毒,实现了在sf9细胞中对BmSxl-PB蛋白的克隆表达。表达的重组BmSXL-PB蛋白带有His6标签和TEV酶切位点,大小约为37KDa,通过Western免疫印迹杂交检测到与理论分子量一致的蛋白条带。因此,家蚕BmSxl-PB基因在sf9细胞中成功实现了融合表达,为研究BmSxl基因功能提供了条件。