HIV-1 env蛋白的制备活性鉴定与快速检测方法的建立

论文摘要

目的:制备具有生物活性的HIV-1 env蛋白,为进一步制备其单克隆抗体与建立新的HIV-1病毒的诊断方法奠定基础;利用量子点的特殊光学性能结合免疫分析技术,将量子点标记HIV-1 env抗原并建立快速、简便的免疫凝集分析检测HIV-1 gp41抗体方法。方法:以HIV-1 env基因质粒为模板,采用体外快速翻译系统（RTS）线性模板试剂盒制备线性模板,用RTS100试剂盒合成env蛋白,用磁珠法纯化蛋白,用Western Blot方法鉴定蛋白活性。并另外将HIV-1 env基因分成三段,即表达HIV-1 gp120前1/2和后1/2以及表达HIV-1 gp41的DNA分别插入pET-32a表达载体中,测序鉴定后,通过IPTG诱导BL21菌种从而表达蛋白。纯化后的各段HIV-1 env蛋白采用量子点标记,与样品液中的抗HIV-1 gp41抗体进行免疫反应,根据量子点的荧光信号的变化,定量检测样品液中抗gp41抗体的浓度,以此建立凝集免疫检测方法。结果:体外快速翻译系统表达出相对分子量约为97KD的env蛋白,利用pET-32a表达载体分段表达HIV-1 env基因。蛋白经过纯化后,Western blotting证实纯化后的蛋白具有生物活性,量子点标记的env蛋白与山羊抗HIV-1 gp41抗体发生了免疫凝集反应,使量子点发生荧光淬灭,荧光信号强度与抗体浓度呈负相关。结论:HIV-1 env蛋白可采用RTS系统进行大量表达,分离纯化后的env蛋白具有生物学活性;HIV-1 env基因分成相应三段后利用pET-32a原核表达载体亦可进行大量表达。量子点标记HIV-1 env蛋白,与山羊抗HIV-1 gp41抗体发生免疫凝集反应,此方法检测HIV gp41结果准确,方法简便。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 人类缺陷免疫病毒
• 1.1.1 生物学诊断
• 1.1.1.1 形态结构
• 1.1.1.2 基因结构及编码蛋白的功能
• 1.1.1.3 培养特性
• 1.1.1.4 抵抗力
• 1.1.2 病毒性与免疫性
• 1.1.2.1 传染源和传播途径
• 1.1.2.2 致病机制
• 1.1.2.3 免疫性
• 1.1.3 HIV/AIDS 流行概况
• 1.1.4 病毒学研究进展
• 1.1.5 HIV/AIDS 感染诊断
• 1.1.5.1 HIV 感染的诊断
• 1.1.5.2 我国使用WB 确认HIV 感染的判定标准和判定结果的基本原则
• 1.1.6 艾滋病治疗的进展
• 1.2 快速翻译系统（Rapid Translation System）
• 1.2.1 PCR 技术原理
• 1.2.2 线形模板生成原理
• 1.3 pET 原核表达系统
• 1.3.1 pET 原核表达系统的介绍
• 1.3.2 用于表达的宿主菌
• 1.3.3 pET32a 图谱
• 1.3.4 氨苄青霉素的使用
• 1.3.5 IPTG 的诱导
• 1.4 量子点概念、制备及研究
• 1.4.1 量子点的概念
• 1.4.2 量子点的制备
• 1.4.3 量子点的应用
• 1.4.3.1 用于细胞和分子生物学研究
• 1.4.3.2 用于肿瘤等疾病的检测和诊断
• 1.4.3.3 用于药物研究和含量测定
• 参考文献
• 第二章 HIV-ⅠENV蛋白的RTS系统表达、纯化及生物学活性的鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 PCR 引物
• 2.2.2 材料与试剂
• 2.2.3 方法
• 2.2.3.1 含HIV-1 env 基因菌体的培养
• 2.2.3.2 含HIV-1 env 基因质粒的提取
• 2.2.3.3 从质粒中扩增出HIV-1 env 基因
• 2.2.3.4 PCR 产物的凝胶回收
• 2.2.3.5 感受态细胞的制备（ CaC12 法）
• 2.2.3.6 HIV-1 env 基因克隆入T 载体
• 2.2.3.7 第一轮PCR 产物电泳结果
• 2.2.3.8 第二轮PCR 扩增与序列分析
• 2.2.3.9 RTS 系统高效表达蛋白与纯化
• 2.2.3.10 Western Blotting 分析
• 2.3 结果
• 2.3.1 T 载体测序结果与基因库结果比较
• 2.3.2 第一轮PCR 及第二轮PCR 产物电泳结果
• 2.3.3 蛋白纯化结果及Western Blot 结果
• 2.4 讨论
• 参考文献
• 第三章 利用PET系统表达部分HIV-1 ENV蛋白
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 PCR 引物
• 3.2.1.2 试剂
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 双酶切反应
• 3.2.2.2 DNA 片段和pET-32a 载体的连接
• 3.2.2.3 转化反应
• 3.2.2.4 菌体的诱导
• 3.3 结果
• 3.3.1 测序结果
• 3.3.2 SDS-PAGE 结果
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 第四章 量子点标记的荧光免疫检测HIV抗体方法的建立
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 试剂和仪器
• 4.2.2 凝集免疫检测方法的建立
• 4.2.2.1 量子点的合成与表征
• 4.2.2.2 CdTe 量子点标记纯化后的env 蛋白
• 4.2.2.3 凝集免疫检测方法的建立
• 4.3 结果
• 4.3.1 建立CdTe 量子点标记的凝集免疫检测方法
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文