蝶啶类表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的设计、合成及其抗癌活性研究

论文摘要

蛋白酪氨酸激酶在细胞的信号传导通路中占据了十分重要的地位，调节着细胞的生长、分化、凋亡等一系列生理生化过程。蛋白酪氨酸激酶功能的失调会引发生物体内的一系列疾病。特别是它们的异常表达不但导致细胞增殖调节发生紊乱，进而导致肿瘤发生，而且还与肿瘤的侵袭和转移，肿瘤新生血管的生成，肿瘤的放化疗抗性密切相关。有效抑蛋白制酪氨酸激酶，可以达到治疗肿瘤的目的。因此，蛋白酪氨酸激酶已成为抗肿瘤药物研究的新靶点。表皮生长因子受体酪氨酸激酶（EGFR）是最早发现的蛋白酪氨酸激酶，EGFR的胞内区有ATP结合位点，EGFR抑制剂可以竞争性与ATP结合位点相结合，从而抑制EGFR的磷酸化过程，阻断下游信号的传导，进而抑制肿瘤细胞的生长、分化和转移。因为EGFR作为抗肿瘤靶点的生化过程正在被逐步阐明，其晶体结构和活性部位也已经比较清楚，以此为靶点的药物吉非替尼（Gefitinib）和埃罗替尼（Erlotinib）已经应用于临床，所以EGFR抑制剂的研究具有较好的前景。通过设计、合成新的化合物，然后进行筛选，我们希望从中能够发现活性好、选择性高的新型结构的先导化合物。人们在以EGFR为靶点设计、合成EGFR抑制剂的探索中发现，苯胺基喹唑啉类化合物有较好的活性和选择性，并总结出了其构效关系。特别是PD0153035的发现，为进一有研究喹唑啉类EGFR抑制剂的构效关系起到了至关重要的作用。以后的许多化合物都是以PD 0153035为先导化合物进行结构改造和修饰的。然而喹唑啉环并非EGFR抑制剂所必须的，在随后的研究中，人们发现许多氮杂喹唑啉类也有很好的活性，如吡啶并[2，3-d]嘧啶类、吡啶并[3，2-d]嘧啶类、吡啶并[4，3-d]嘧啶类、吡啶并[3，4-d]嘧啶类、嘧啶并[5，4-d]嘧啶类，也就是在喹唑啉环的5,6,7,8-位都可以氮杂，且都有活性。另外五元环也可和嘧啶环稠和，如吡咯并[2，3-d]嘧啶类、吡唑并[3，4-d]嘧啶类也有较好的前景。上述研究成果使我们想到了蝶啶环，因为蝶啶可看作是喹唑啉环的5,8-位氮杂环，而且取代基在6-位是天然蝶啶化合物的普通模式。鉴于此，根据该类化合物的构效关系，以PD 0153035为先导化合物，利用生物电子等排理论，设计了两类蝶啶类衍生物——6-烷氧基-4-芳胺基蝶啶类化合物Ⅰ和6,7-双烷氧基-4-芳胺基蝶啶类化合物Ⅲ，结构如下图所示：其中，R1，R2=烷基，R=Cl，Br,F，CH3等。蝶啶类化合物在生物体内有着广泛的生理活性，从而为新药开发提供了新的母核，如在抗肿瘤药物、腺苷激酶抑制剂、一氧化氮合成酶抑制剂等中都有报道。目前，蝶啶类化合物国外研究较多，但国内研究较少，特别是烷氧基取代的蝶啶衍生物的合成很少见报道。由于未检索到该类化合物的类似合成报道，我们对设计的目标化合物进行逆合成分析，经反复实验探索，不断对合成工艺进行修改和调整，最终找到了切实可行的合成路线。在合成Ⅲ类化合物的过程中，我们意外发现N4-芳基-4,5,6-三氨基嘧啶在和草酸环合时，具有区域选择性，最终导致了N8-芳基-6-烷氧（胺）基-4-氨基-7（8H）蝶啶酮类化合物Ⅱ的发现（如上图所示）。采用柔性分子对接方法对所设计的三类蝶啶化合物以及参考化合物Iressa与EGFR进行了分子对接研究，了解了设计化合物与EGFR的结合方式及相互作用机制，结果显示，设计的化合物能进入到ATP的结合区，并与ATP的结合位点有着较强的疏水作用和静电相互作用，为针对性设计或改善酪氨酸酶抑制剂提供了科学依据。对Ⅰ类化合物的合成，我们用3-氨基吡嗪-2-甲酸经酯化、酯氨解、溴化、环合、烷氧基取代、氯化和芳胺取代7步反应而得到。总收率达39％以上。根据烷氧基和芳胺的不同，我们制备了20个未见文献报道的新化合物。对Ⅱ类化合物的合成，我们以丙二酸二乙酯为原料，经环合、硝化、氯化、芳胺取代、氨取代、还原、草酸环合、氯代、烷氧基或胺取代9步反应而得到。总收率达22％以上。根据芳胺和侧链的不同，我们合成了13个未见文献报道的新化合物。对Ⅲ类化合物的合成，我们用3-氨基吡嗪-2-甲酸经酯化、氯化、烷氧基取代、酯水解、内酯化、氨解环合、烷氧基取代、氯化和芳胺取代9步反应而得到。总收率达26％以上。根据芳胺的不同，我们制备了5个未见文献报道的新化合物。上述所有化合物的结构均经1H NMR、13C NMR、ESI-MS和元素分析确证。在合成各类化合物的过程中，共得到未见文献报道的新型中间体50多个，并根据其结构特征，用相应的光谱对其结构进行确证。在对Ⅱ类化合物的合成中，N4-芳基-4,5,6-三氨基嘧啶在和草酸环合时，可能得到两种异构体，因为结构的相似性，用1H NMR、13C NMR、MS和元素分析不易确定，而其本身的溶解性较差，其氯化后的产品有较好的溶解性，我们对氯化产品培养了单晶，通过对单晶的分析，了解了环合的方式，发现了该环合反应的区域选择性。同时通过对脂肪族取代的三氨基嘧啶与草酸的环合反应的研究，发现两种环合方式都存在，这又说明了该环合反应的局限性，只能用于N4-芳基-4,5,6-三氨基嘧啶与草酸的环合。用MTT法对Ⅱ类化合物进行了体外培养的人肿瘤细胞的细胞增殖毒性试验，选取人早幼粒细胞白血病HL-60细胞、人胃腺癌SGC-7901细胞和人结肠癌SW-480细胞三种癌细胞为试验对象，用5-氟尿嘧啶为阳性对照。结果表明，所设计的Ⅱ类化合物对SGC-7901有较好的抑制作用，部分化合物对HL-60细胞也有明显的抑制作用，个别化合物在相似浓度下对SGC-7901和HL-60细胞的抑制作用和对照药物5-氟尿嘧啶相当。对SW-480细胞的抑制作用很弱。Ⅰ和Ⅲ类化合物的药理实验正在进行中。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 第一节 抗肿瘤药物研究的重要性
• 第二节 表皮生长因子受体酪氨酸激酶的结构和信号传导途径
• 第三节 EGFR家族及其与肿瘤的关系
• 第四节 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的研究进展
• REFERENCES
• 第二章 蝶啶类EGFR抑制剂的设计
• 第一节 EGFR抑制剂构效关系
• 第二节 蝶啶类EGFR抑制剂的设计
• 第三节 EGFR与蝶啶衍生物的分子对接研究
• REFERENCES
• 第三章 6-烷氧基4-芳胺基蝶啶类化合物的合成
• 第一节 合成路线的设计与探索
• 第二节 实验部分
• 第三节 结果与讨论
• REFERENCES
• 8-芳基-6-烷氧（胺）基-4-氨基-7（8H）-蝶啶酮的合成'>第四章 N⁸-芳基-6-烷氧（胺）基-4-氨基-7（8H）-蝶啶酮的合成
• 第一节 合成路线的设计与探索
• 第二节 实验部分
• 第三节 结果与讨论
• REFERENCES
• 第五章 6,7-双烷氧基-4-芳胺基蝶啶类化合物的合成
• 第一节 合成路线的设计与探索
• 第二节 实验部分
• 第三节 结果与讨论
• REFERENCES:
• 8-芳基-6-烷氧（胺）基-4-氨基-7（8H）-蝶啶酮的药理活性'>第六章 N⁸-芳基-6-烷氧（胺）基-4-氨基-7（8H）-蝶啶酮的药理活性
• 一、实验方法
• 二、实验步骤
• 三、实验结果及讨论
• 总结论
• 附图
• 致谢
• 攻读博士期间发表的论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附外文论文
• APPENDIX Ⅰ
• APPENDIX Ⅱ