转基因油菜品系特异性检测方法研究及其标准分子研制

论文摘要

本研究对我国进口油菜籽进行转基因成分检测并分析了各品系组成情况,结果显示,我国农业部颁发农业转基因生物安全生产证书的七个转基因油菜品系（RT73、MS8×RF3、MS1×RF1、MS1×RF2、T45、Oxy235和Topas19/2品系）均有进口,其中以RT73和MS8×RF3品系为主。本研究构建了适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子pEASY-RT73和适于七种转基因油菜品系特异性检测的通用标准分子pCanola9,对其在定性和定量检测中的适用性进行了实验室内部验证。结果表明两种标准分子具有高特异性；在普通PCR扩增中,检测下限（LOD）均低于20拷贝；在实时荧光PCR扩增中,检测下限均低于25拷贝；定量下限（LOQ）均低于为50拷贝。针对以上体系制作的标准曲线具有很好线性关系和较高反应效率。基于此,本研究进一步对标准分子进行可重复性、均匀性、热稳定性和盲样测试。建立了适用于转基因油菜品系特异性检测的方法,研制成功的标准分子可很好的替代植物来源阳性标准品用于转基因油菜及其来源产品品系特异性检测,并为解决转基因产品检测标准物质缺乏的难题提供有力的技术支持。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 综述与导言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 检测技术
• 1.2.2 标准物质
• 1.2.3 标准分子
• 1.3 本课题的目的和意义
• 第2章 进口油菜籽中不同转基因品系的检测与分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验样品
• 2.2.2 试剂
• 2.2.3 仪器
• 2.3 方法
• 2.3.1 油菜籽DNA提取和制备
• 2.3.2 DNA浓度的测定
• 2.3.3 实时荧光PCR扩增
• 2.3.4 普通PCR扩增
• 2.4 结果和分析
• 2.4.1 油菜籽样品转基因成分筛选检测
• 2.4.2 油菜籽样品中七种转基因油菜品系检测
• 2.4.3 转基因油菜品系检测结果验证
• 2.5 结论与讨论
• 第3章 适于转基因油菜RT73品系特异性检测的标准分子构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 实验样品
• 3.2.2 试剂
• 3.2.3 仪器
• 3.3 方法
• 3.3.1 油菜籽DNA提取和制备
• 3.3.2 标准分子pEASY-RT73的构建
• 3.3.3 标准分子菌液制备
• 3.3.4 质粒DNA提取
• 3.3.5 DNA浓度的测定
• 3.3.6 普通PCR扩增
• 3.3.7 凝胶电泳
• 3.3.8 实时荧光PCR扩增
• 3.3.9 标准分子用于普通PCR适用性鉴定
• 3.3.10 标准分子用于实时荧光PCR适用性鉴定
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 标准分子构建
• 3.4.2 标准分子用于普通PCR检测的适用性鉴定结果
• 3.4.3 标准分子用于实时荧光PCR检测的适用性鉴定结果
• 3.5 结论与讨论
• 第4章 适于七种转基因油菜品系特异性检测的通用标准分子构建及其适用性鉴定
• 4.1 引言
• 4.2 材料
• 4.2.1 实验样品
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 仪器
• 4.4 方法
• 4.4.1 植物基因组DNA提取
• 4.4.2 标准分子pCanola9的构建
• 4.4.3 标准分子质粒菌液制备
• 4.4.4 标准分子质粒DNA提取
• 4.4.5 DNA浓度的测定
• 4.4.6 普通PCR扩增
• 4.4.7 实时荧光PCR扩增
• 4.4.8 标准分子用于普通PCR的适用性鉴定
• 4.4.9 标准分子用于普通PCR的适用性鉴定
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 标准分子构建
• 4.5.2 标准分子用于普通PCR检测的适用性鉴定
• 4.5.3 标准分子用于实时荧光PCR检测的适用性鉴定
• 4.6 结论与讨论
• 第5章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢