论文摘要
目的:通过研究青藤碱（Alkaloid sinomenine, SIN）对人外周血CD4+ T淋巴细胞增殖及细胞内活化T细胞的核因子（nuclear factor of activated T cells,NF-AT）和干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）蛋白表达的体外影响,进一步探讨SIN对人外周血CD4+ T淋巴细胞的免疫抑制作用,为SIN在器官移植免疫治疗的临床应用提供理论依据。方法:在衡阳市中心血站采集一健康人肘静脉血50ml,肝素（10U/ml）抗凝。用淋巴细胞分离液从血液标本中分离人外周血单个核细胞（human peripheral blood mononuclear cells,PBMC）,并制成PBMC悬液。通过免疫磁珠分离法从PBMC悬液中分选CD4+T淋巴细胞。将得到的CD4+ T淋巴细胞用10%小牛血清（fetal calf serum,FCS）RPMI-1640完全培养液在37℃、5%CO2条件下培养。CD4+ T淋巴细胞经植物血凝素（Phytohemagglutinin,PHA,终浓度为5μg/ml）和白介素-2（Interleukin-2,IL-2,终浓度为100U/ml）扩增,将扩增后的细胞用PBS洗3遍,继续培养（细胞培养液中不含rIL-2和PHA）1天后,按照以下方式均分为5组细胞（每组3份）:1)对照组:细胞培养液中不加入任何药物;2)CsA组:细胞培养液中加入终浓度为50ng/ml的CsA溶液;3)低浓度SIN组:细胞培养液中加入终浓度为10μmol/L的SIN溶液;4)中浓度SIN组:细胞培养液中加入终浓度为200μmol/L的SIN溶液; 5)高浓度SIN组:细胞培养液中加入终浓度为1000μmol/L的SIN溶液。6小时后,各组细胞培养液中加入终浓度为1μg/ml的抗CD3单克隆抗体。再培养24小时后,对各组细胞进行以下检测:1)Western blotting法检测NF-AT的蛋白表达;2)MTT比色法检测细胞增殖;3)FCM检测IFN-γ表达水平。结果:1、Western blotting法检测NF-AT蛋白的相对表达量:1)对照组:1.3459+0.0063;2)CsA组:0.2959+0.0118;3)低浓度SIN组:1.3047+0.0036;4)中浓度SIN组:0.8965+0.0272;5)高浓度SIN组:0.4900+0.0112。低浓度SIN组与对照组比较,差异无显著性（P>0.05）;其余各组两两比较,差异均有显著性（P<0.05）;CsA组NF-AT的蛋白表达最低;SIN浓度与人外周血CD4+ T淋巴细胞NF-AT蛋白表达之间存在显著负相关关系（rs=-0.940,r2s=0.883,v=7,P=0.000）。2、MTT比色法测定OD值,计算细胞增殖抑制率（%）:1)对照组:0.00±0.00;2)CsA组: 75.98±2.05;3)低浓度SIN组:2.41±0.14;4)中浓度SIN组:31.49±2.04;5)高浓度SIN组:44.25±0.91。低浓度SIN组与对照组比较,差异无显著性（P>0.05）;其余各组两两比较,差异均有显著性（P<0.05）;细胞增殖抑制率由高到低依次为:CsA组、高浓度SIN组、中浓度SIN组、低浓度SIN组、对照组;SIN浓度与人外周血CD4+T细胞增殖抑制率之间存在正相关关系（rs=0.844,r2s=0.712,v=7,P=0.004）。3、经不同浓度的SIN处理后,人外周血CD4+T淋巴细胞增殖抑制率与细胞NF-AT蛋白表达之间存在显著负相关关系（rs=-0.969,r2s=0.940,v=7,P=0.000）。4、FCM检测IFN-γ表达（%）:1)对照组:21.07±0.36;2)CsA组:8.91±0.38;3)低浓度SIN组:20.48±0.87;4)中浓度SIN组:15.19±0.25;5)高浓度SIN组:9.81±0.11。低浓度SIN组与对照组比较,差异无显著性（P>0.05）;其余各组两两比较,差异均有显著性（P<0.05）;SIN浓度与人外周血CD4+ T淋巴细胞IFN-γ的表达率之间存在负相关关系（rs=-0.939,r2s=0.882,v=7, P=0.000）;5、经过不同浓度SIN处理后,人外周血CD4+T细胞NF-AT蛋白表达相对值与IFN-γ表达水平之间存在显著正相关关系（rs=0.991,r2s=0.982,v=7,P=0.000）。结论:1、SIN呈浓度依赖性降低人外周血CD4+T淋巴细胞NF-AT的蛋白表达;2、SIN呈浓度依赖性抑制人外周血CD4+T淋巴细胞的增殖;3、SIN对人外周血CD4+T淋巴细胞增殖的抑制与其降低NF-AT蛋白表达相关;4、SIN呈浓度依赖性下调人外周血CD4+T淋巴细胞IFN-γ的表达水平;5、SIN下调人外周血CD4+T淋巴细胞IFN-γ的表达与其降低NF-AT蛋白表达相关。