磷脂酶C基因的过表达对玉米转基因植株抗逆性的影响

论文摘要

磷酸肌醇信号途径在高等植物的生长、发育及对环境胁迫反应中发挥重要作用。磷脂酶C（phospholipase C,PLC）是磷酸肌醇信号途径中的关键酶。细胞外信号通过细胞膜受体激活磷酸肌醇特异的磷脂酶C（Phosphoinositide-specificphospholipase C,PI-PLC）,后者通过催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（phosphatidylinositol 4,5-biphosphate,PIP2）水解产生二酯酰甘油（diacylglycerol,DAG）和三磷酸肌醇（trisphosphate inositol,IP3）。在植物中,DAG在二酯酰甘油激酶（DGK）的作用下快速转变为磷脂酸（PA）。IP3和PA作为植物细胞中重要的次级信使,在植物对非生物胁迫反应中起重要作用。与动物系统相比,人们对植物中磷脂酶C基因的生理功能知之甚少。本论文通过转基因技术使玉米磷脂酶C基因ZmPLCl在玉米中过表达或抑制表达来研究该基因在玉米对逆境胁迫反应中所起的作用。非生物胁迫例如干旱、盐碱和低温是限制作物产量和质量的重要因素,培育对非生物逆境抗性强的作物新品种是满足社会对于农产品日益增长需求的重要措施。玉米（Zea mays L.）是一种重要的农作物,通过基因工程创造玉米抗逆境新品种是一项具有重要意义的工作。本研究采用农杆菌介导法将来源于玉米的磷脂酶C基因ZmPLCl（±）转入玉米骨干自交系,获得了可育的转基因植株;对转基因玉米中外源基因在后代的遗传和目标产物的表达活性进行了分析;检测了转基因植株的抗旱、耐盐和耐冷性,肯定了ZmPLCl基因在玉米中的过表达可提高转基因植株的抗逆性,为玉米抗逆育种提供了有重要价值的材料。一、农杆菌介导的玉米骨干自交系的转化及分子生物学检测在本研究中,用携带Mini-Ti质粒pCUA-ZmPLCl-als（ZmPLCl以正义或反义形式,als:除草剂绿磺隆抗性基因）的农杆菌菌株LBA4404转化玉米Ⅱ型胚性愈伤组织。转化后的愈伤组织经0.5-1.0mg/L绿磺隆筛选3代,存活的愈伤组织经恢复培养后进行分化,再生出表达正义或反义ZmPLCl基因的转基因植株。后者经人工授粉自交结实。对转基因植株当代以及后代进行PCR、Southern blot和real-time RT-PCR分析,表明外源基因已经整合入玉米基因组中并稳定表达。转基因植株Southern blot分析显示,在大多数转化体中外源基因以单拷贝插入。取外源基因发生单拷贝插入的转基因株系,提取总RNA进行real-time RT-PCR检测,以非转基因植株叶片的总RNA为对照测定转基因植株中ZmPLCl基因的相对表达水平。结果表明,转正义基因株系中ZmPLCl基因的表达水平远远高于非转基因的。选取4个转基因株系（包括两个正义株系、两个反义株系）进行PI-PLC酶活性检测和抗逆性分析,以非转基因植株作为对照。酶活性检测得出转正义基因株系中PI-PLC活性是非转基因对照的2-3倍,而转反义基因株系中PI-PLC活性低于对照。这些结果表明转基因株系中PI-PLC活性的升高或降低源于转基因的表达。二、转基因玉米的抗旱性分析当玉米种子在含15%或20%（w/v）PEG-6000的MS无机盐溶液浸润的双层滤纸之间萌发时,转ZmPLCl正义基因种子比非转基因对照萌发快,最终萌发率高;转反义基因种子的萌发速率和非转基因对照相近,但最终萌发率低。随着渗透胁迫强度的增加,转基因种子和非转基因对照在最终萌发率上的差异增大。待玉米幼苗长至三叶期,将根系置于含12%（w/v）PEG-6000的MS无机盐溶液中渗透胁迫处理1、3、7天。渗透胁迫条件下,转ZmPLCl正义基因株系的叶片叶绿素含量和相对含水量较高、细胞膜损伤程度较低、溶质势较低、叶片中积累的可溶性糖和游离氨基酸含量也高于非转基因对照的;而转ZmPLCl反义基因株系的上述生理参数劣于非转基因对照的。渗透胁迫处理对玉米叶片的内源激素含量产生了深刻的影响,但不同株系的变化不同:转正义基因植株叶片中ABA、IAA、ZT、GA3含量高于非转基因对照和转反义基因植株的。形态观察表明,高水平的内源激素有利于植株抵御渗透胁迫。转正义或反义ZmPLCl基因影响了渗透胁迫下玉米幼苗内源激素含量的变化,这种变化与植株抗渗透胁迫能力的变化相对应。外源应用ZT和GA3能促进渗透胁迫下玉米幼苗的生长并能部分抑制叶绿素的降解,并使不同基因型植株在生长和叶绿素分解速率上的差异减小。对10叶期玉米植株进行控制浇水处理,维持土壤中相对含水量在15%左右,使植株受到干旱胁迫。控水处理3周后充足浇水,恢复植株正常生长和发育。在干旱处理过程中,转正义基因植株的光系统Ⅱ活性的降低和净光合速率的减少均比非转基因对照低,而转反义基因植株的光系统Ⅱ活性的降低和净光合速率的减少比非转基因对照高。经历干旱胁迫后,转正义基因植株的生长和发育未受到显著影响,而非转基因对照和转反义基因植株的生长和发育明显受到抑制。开花期统计玉米植株的株高、绿叶数目和穗位叶长度,得出转正义基因植株的株高、绿叶数目和穗位叶长度均显著高于非转基因植株的,而转反义基因植株的株高、绿叶数目和穗位叶长度均低于非转基因植株的。果穗成熟后,转正义基因植株地上部生物量（以干重计）比非转基因植株多11.4-17.8%,单株籽粒重比非转基因的高10.5-17.7%:而转反义基因植株的地上部生物量和单株籽粒重分别比非转基因对照的低6.9-12.6%和7.5-14.4%。即ZmPLCl过表达能提高植株在干旱胁迫条件下的生物量和籽粒产量,抑制ZmPLCl表达则降低植株的抗旱性。三、转基因玉米的耐盐性测定将玉米种子置于附加150或200mM NaCl的MS无机盐溶液浸润的双层滤纸之间萌发。在低胁迫强度（150mM NaCl）下,转基因种子和非转基因对照之间没有显著差异。在200mM NaCl胁迫条件下,转正义基因种子的最终萌发率高于非转基因对照的,而转反义基因种子的最终萌发率比非转基因对照种子略低。四叶期玉米幼苗置于含有120mM NaCl的MS无机盐溶液中进行盐胁迫处理6、12、18天,然后用不含NaCl的MS无机盐溶液恢复培养6、12天。在盐胁迫处理期间,和非转基因对照相比,转正义ZmPLCl基因植株的生长发育受抑制较小,叶片的叶绿素含量和相对含水量较高、细胞膜损伤较低、可溶性糖和游离氨基酸含量较高;而转反义ZmPLCl基因植株在盐胁迫下受害严重。在盐胁迫处理后的恢复阶段,不同玉米株系之间的差异逐渐减小,但转正义ZmPLCl基因植株的生长发育仍然较好。即ZmPLCl过表达提高了植株对盐胁迫的耐受性。四、转基因玉米的耐冷性检测在25℃下萌发,转基因种子与非转基因对照的最终萌发率均在85%以上,没有明显差异。在15℃下萌发,所有玉米种子的萌发率均降低,但降低幅度不同:转正义ZmPLCl基因种子的萌发率高于非转基因对照的,而转反义ZmPLCl基因种子的萌发率低于非转基因对照的;种子的萌发时间也明显推迟,但株系间差异不大。在10℃下萌发,不同玉米种子的萌发时间均大大推迟且最终萌发率显著降低,其中转正义ZmPLCl基因的种子比非转基因和转反义基因的种子提前萌发3-5天,且最终萌发率高。在正常生长温度（25℃）下,转基因与非转基因玉米幼苗的生长速率无显著差异。15℃下,所有玉米幼苗的生长速率均明显降低,但降低幅度不同:相比于25℃条件下,转ZmPLCl反义基因幼苗生长速率降低幅度最大,非转基因幼苗次之,转正义ZmPLCl基因幼苗生长速率降低幅度较小。10℃下,所有玉米株系的幼苗生长速率均显著降低:转ZmPLCl正义基因幼苗的生长速率约为25℃下的17.4-18.9%,而非转基因幼苗降低为11.2%,转ZmPLCl反义基因幼苗的生长速率只有25℃下的5.2-7.5%。将25℃下生长到四叶期的玉米幼苗置于10/8℃（昼/夜）进行低温胁迫处理8天,然后于25℃下恢复生长8天。在低温胁迫处理过程中,转正义ZmPLCl基因植株的受害程度明显小于非转基因和转反义基因的。生理指标测定结果表明,与非转基因植株相比,转ZmPLCl正义基因植株叶片细胞膜的损伤程度较低、叶绿素含量较高,叶片细胞的可溶性糖和游离氨基酸水平也较高。在低温胁迫处理后的恢复期,转正义基因植株和非转基因植株均能快速恢复生长,而转反义基因植株恢复生长缓慢,显示出受伤害较重。综上所述,对转正义和反义ZmPLCl基因玉米植株的抗逆性分析得出,ZmPLCl基因过表达的植株对干旱胁迫的抗性明显增强,耐盐、耐冷性也有不同程度的提高。ZmPLCl基因为逆境诱导表达基因,可以认为ZmPLCl基因在玉米对逆境条件的应答反应中起重要作用,可能是信号链中的重要成员,通过对该基因表达的遗传操作能够改变玉米的抗逆性。因此,利用分子生物学和生理生化技术深入揭示了磷脂酶C基因在逆境信号传递及放大中的作用具有重要意义,有望为作物抗逆育种开辟新途径。

论文目录

中文摘要

ABSTRACT

符号说明

第一章前言

1.1 磷脂信号途径

1.2 磷脂酶C研究进展

1.3 植物PI-PLC生理功能

1.4 玉米抗逆性研究

1.5 玉米遗传转化研究概况

1.6 本研究的目的和意义

第二章农杆菌介导的玉米骨干自交系的遗传转化

2.1 材料与方法

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 培养基

2.1.4 农杆菌的培养

2.1.5 玉米愈伤组织的转化

2.1.6 转基因植株的分子检测

2.1.7 PI-PLC活性分析

2.1.8 转基因株系的遗传学分析

2.2 结果与分析

2.2.1 玉米胚性愈伤组织的诱导和转基因植株的获得

2.2.2 转基因植株的分子检测

2.2.3 PI-PLC活性分析

2.2.4 遗传分析

2.2.5 不同基因型玉米的转化率

第三章转 ZmPLC1基因玉米植株的抗旱性分析

3.1 材料和方法

3.1.1 植物材料

3.1.2 种子的萌发

3.1.3 幼苗的渗透胁迫处理

3.1.4 相对含水量和叶绿素含量的测定

3.1.5 细胞膜离子渗漏和丙二醛（MDA）含量的测定

3.1.6 渗透势、可溶性糖和游离氨基酸的测定

3.1.7 内源激素的提取、纯化和测定

3.1.8 渗透胁迫条件下外源激素的应用

3.1.9 开花前期干旱胁迫

3.1.10 叶绿素荧光和气体交换速率的测定

3.1.11 植株的生长发育

3.2 结果与分析

3.2.1 渗透胁迫对种子萌发的影响

3.2.2 渗透胁迫下玉米幼苗的生长

3.2.3 渗透胁迫下玉米叶片相对含水量和叶绿素含量的变化

3.2.4 渗透胁迫下玉米叶片细胞膜离子渗漏和丙二醛含量的变化

3.2.5 渗透胁迫下玉米叶片渗透势、可溶性糖和游离氨基酸含量

3.2.6 渗透胁迫对玉米叶片内源激素含量的影响

3.2.7 外源激素应用对渗透胁迫下玉米幼苗的影响

3.2.8 干旱胁迫对玉米植株生长和光合作用的影响

3.2.9 干旱胁迫对玉米植株发育的影响

3.2.10 干旱胁迫对玉米生物量和产量的影响

3.3 讨论

第四章转ZmPLC1基因玉米植株的耐盐性分析

4.1 材料和方法

4.1.1 植物材料

4.1.2 种子的萌发

4.1.3 植物材料的盐胁迫处理

4.1.4 生理指标的测定

4.2 结果与分析

4.2.1 玉米种子的萌发试验

4.2.2 盐胁迫下玉米幼苗的生长

4.2.3 玉米叶片细胞膜离子渗漏和丙二醛含量的变化

4.2.4 玉米叶片相对含水量和叶绿素含量的变化

4.2.5 玉米叶片可溶性糖和游离氨基酸含量

4.3 讨论

第五章转ZmPLC1基因玉米植株的耐冷性分析

5.1 材料和方法

5.1.1 植物材料

5.1.2 种子的萌发

5.1.3 植物材料的冷处理

5.1.4 生理指标的测定

5.2 结果与分析

5.2.1 玉米种子的发芽势

5.2.2 玉米幼苗生长速率的变化

5.2.3 玉米幼苗的冻伤及恢复

5.2.4 玉米叶片叶绿素含量的变化

5.2.5 玉米叶片细胞膜离子渗漏和丙二醛含量的变化

5.2.6 玉米叶片可溶性糖和游离氨基酸含量

5.2.7 低温胁迫对玉米生物量的影响

5.3 讨论

第六章讨论与结语

6.1 ZmPLC1基因在玉米中的过表达提高了转基因玉米的抗逆性

6.2 磷脂酶C基因在植物抗逆反应中的作用机理

6.2.1 磷脂酶C与其它信号分子之间的关系

6.2.2 ZmPLC1基因作用的可能机理

6.3 转ZmPLC1基因研究的启示

参考文献

致谢

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附录

磷脂酶C基因的过表达对玉米转基因植株抗逆性的影响

论文摘要

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