安徽部分地区奶牛隐孢子虫感染情况调查及其基因型研究

论文摘要

隐孢子虫病（Cryptosporidisis）是由隐孢子虫（Cryptosporidium）引起的一种以腹泻为主要临床表现的呈世界性分布的人畜共患寄生虫病,该病严重危害人类健康和畜牧业生产,也是人类艾滋病患者的主要致死因素之一。美国疾病预防控制中心将其列为B类病原。2003年该病被列为我国重点防范的两种重要寄生虫病之一。近年来,隐孢子虫病研究在病原生物学、形态学、流行病学、分子生物学、诊断及综合防治技术等方面取得许多重要成果;但是由于隐孢子虫虫种间形态差异不明显,国内外又缺少隐孢子虫统一的分类标准,加之近年来分子生物学技术的应用,隐孢子虫新基因型的报道不断出现,造成了隐孢子虫种类的确切数目一直不很清楚,这给预防和控制该病带来了极大困难。本课题旨在通过对安徽省四个奶牛场奶牛隐孢子虫感染情况进行调查,以便初步摸清安徽省奶牛隐孢子虫感染情况;从阳性奶牛粪样中分离隐孢子虫卵囊,并采用形态学和分子生物学方法对所获卵囊进行鉴定,试图从分子水平上探明安徽省奶牛源隐孢子虫虫种类型,为人畜共患隐孢子虫病的防控提供理论依据。首先采用饱和白糖溶液漂浮法对安徽省四个奶牛场502份奶牛粪样进行检测,其中在D场粪样中未检出隐孢子虫卵囊。而在A、B和C3个场粪样中检出了隐孢子虫卵囊。根据所获卵囊的形态、大小、结构、卵形指数等特征,初步鉴定安徽省奶牛源隐孢子虫为安氏隐孢子虫（Cryptosporidium andersoni）。经显著性检验,B场的奶牛隐孢子虫的感染率极显著的高于C场（P＜0.01）;而A和B两个场的奶牛隐孢子虫感染率差异也极显著（P＜0.01）。4个场的感染率范围为0%～14.79%,平均感染率为5.18%。对不同年龄段奶牛隐孢子虫感染率进行统计、分析后发现:犊牛与青年牛之间隐孢子虫阳性率差异显著（0.01＜p＜0.05）,犊牛与产奶牛之间隐孢子虫阳性率差异极显著（p＜0.01）。青年牛与产奶牛差异不显著（p＞0.05）。其次对白糖密度梯度离心纯化法,乙醚-饱和硫酸锌纯化法,Sheather’s白糖漂浮法等3种隐孢子虫卵囊纯化方法进行比较。结果表明:3种纯化方法中,白糖密度梯度离心法纯化效果最好,回收卵囊中杂质较少,且实验成本较低。Sheather’s白糖漂浮法回收量较高,但由于白糖粘性较大,限制了卵囊与杂质的有效分离,造成回收卵囊中杂质较多,影响PCR反应效果。乙醚-饱和硫酸锌漂浮法,卵囊回收量和纯化效果次于前两种方法。再次采用白糖密度梯度离心法对分离的隐孢子虫卵囊进行纯化。取纯化的卵囊,先加裂解液（2%DTT,1×TE）,再将卵囊放入-70℃冰箱反复冻融三次,提取模板DNA。根据隐孢子虫18SrRNA序列,设计并合成隐孢子虫特异性引物,扩增出540 bp的片段。初始PCR产物进一步作套式PCR,扩增出一条250 bp特异性的片段。根据隐孢子虫HSP70基因序列,设计合成隐孢子虫特异性引物,扩增出448 bp条带,再以此产物做模板进行套式PCR,扩增出325 bp条带。最后使用PCR产物回收试剂盒,对产物进行回收,纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。然后根据GenBank相关序列,以DNAStar,MEGA3.1等软件对序列进行比较分析,构建种系进化树,为使结果尽可能准确,本次试验采用了邻近相连法（NJ）,最大简约法（MP）两种不同的算法构建进化树。软件分析结果表明,此次所得到的两种进化树很相似。从分子水平进一步证实安徽省奶牛源隐孢子虫为安氏隐孢子虫（C.andersoni）。综上所述,本课题所获的结果为今后安徽省奶牛隐孢子虫病的防治提供了理论依据;所建立的隐孢子虫分子鉴定方法及基因型研究结果,为今后人畜共患隐孢子虫病的研究及隐孢子虫的病原监测等提供了一些有意义的参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 采用病原学方法检测奶牛粪便中隐孢子虫
• 1.3.1 粪样的采集
• 1.3.2 虫体的检查
• 1.4 采用PCR和套式PCR方法检测奶牛粪便中隐孢子虫
• 1.4.1 隐孢子虫卵囊分离和纯化
• 1.4.2 隐孢子虫的DNA抽提
• 1.4.3 PCR和套式PCR反应
• 1.4.4 扩增产物检测
• 1.4.5 PCR产物的纯化
• 1.4.6 PCR产物测序
• 1.4.7 序列分析和进化树绘制
• 2 结果与分析
• 2.1 奶牛隐孢子虫感染情况调查
• 2.1.1 病原学方法检测结果
• 2.1.2 安徽省奶牛隐孢子虫感染情况
• 2.2 隐孢子虫基因型鉴定
• 2.2.1 隐孢子虫18SrRNA扩增与序列分析
• 2.2.2 隐孢子虫HSP70序列的扩增和序列分析
• 3 讨论
• 3.1 隐孢子虫卵囊的纯化
• 3.2 安徽部分地区奶牛隐孢子虫感染情况
• 3.3 分子生物学方法在奶牛隐孢子虫检测中的应用
• 3.4 安徽省奶牛源隐孢子虫分子鉴定
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文