有关SAM合成酶的代谢与基因工程研究

论文摘要

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-L-methionine,简称SAM 或AdoMet）是生物体内重要的中间代谢物质,参与多种生化反应,具有广泛和多样的治疗作用。通过微生物的发酵进而提取SAM 是目前SAM 的主要工业生产途径。SAM 的生产一直以S.cerevisiae发酵为主。本实验室通过合理改造Pichia pastoris 的代谢通路,获得了一株组成型表达SAM合成酶2（SAM2）的重组P.pastoris菌株。为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母（P.pastoris）中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR 方法从P.pastoris 染色体中扩增了GAP 启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K 上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K。将腺苷甲硫氨酸合成酶Ⅱ（SAM）基因重组于pGAP9K 的多克隆位点,获得含SAM 基因的重组质粒pGAP9K-SAM。转化P.pastorisGS115,对获得的高拷贝转化子P.pastoris GS115（pGAP9K-SAM）进行组成型表达,同时以诱导型转化子P.pastoris GS115（pPIC9K-SAM）作为对照。组成型转化子培养4d 后SAM2 的表达酶活已达到高峰; 而诱导型转化子诱导6d 后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时（4d）的81%。以上结果表明,以GAP 启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P.pastoris 中表达SAM 及其他外源蛋白。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 综述
• 1.1 SAM 的医药用途
• 1.2 有关SAM 合成酶的代谢与基因工程研究
• 1.3 SAM 生产方法
• 1.4 Pichia pastoris 表达系统
• 1.5 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.3 实验方法
• 3 结论与分析
• 3.1 腺苷甲硫氨酸合成酶基因和GAP 启动子的克隆
• 3.2 甲醇酵母表达载体的构建和转化
• 3.3 腺苷甲硫氨酸合成酶表达分析
• 3.4 HPLC 检测结果
• 3.5 组成型表达与甲醇诱导型表达酶活力比较
• 4 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1 攻读硕士学位期间发表的论文目录