检疫性实蝇分子生物学快速鉴定技术的研究

论文题目: 检疫性实蝇分子生物学快速鉴定技术的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物学

作者: 余道坚

导师: 尹文英

关键词: 检疫性实蝇,基因,实时荧光,探针实时荧光,鉴定,克隆

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 实蝇科Tephritidae 昆虫是双翅目Diptera 的大科之一,全世界已描述的种类超过450 属4300 余种,其中包括地中海实蝇Ceratitis capitata 在内的70 余种是农业上有重要经济意义的害虫。实蝇的鉴定是国际果蔬贸易中最突出的技术问题之一,建立检疫性实蝇特别是未成熟虫态快速可靠的鉴定方法在植物检疫上有重要的意义。本项研究以国内外普遍关注的检疫性实蝇为研究对象,测定了果实蝇属Bactrocera 和小条实蝇属Ceratitis 共10 亚属28 种检疫性实蝇的mtDNA COI 基因部分序列,获得32 条基因片段(长约670bp);对这些基因序列与已公开报道的其它同源序列进行比较分析,自行设计和筛选特异引物14 对(亚属特异引物2 对,种特异引物12 对)和TaqMan MGB 探针4 条,用于检疫性实蝇的分子生物学快速鉴定研究。主要研究结果如下: I.首次建立了SYBR Green 实时荧光PCR 快速鉴定检疫性实蝇的方法。利用自行设计的特异引物,应用SYBR Green 实时荧光PCR 技术,分别建立了SYBR Green 实时荧光PCR(SG-PCR)快速鉴定地中海实蝇C. capitata、杨桃实蝇B. carambolae、番石榴实蝇B. correcta、桔小实蝇B. dorsalis、辣椒实蝇B. latifrons、芒果实蝇B. occipitalis、木瓜实蝇B. papayae、菲律宾实蝇B. philippinensis、瓜实蝇B. cucurbitae 和南瓜实蝇B. tau 等10 种检疫性实蝇的方法,SYBR Green 实时荧光PCR 产物的特异性通过溶解曲线分析(MCA)来确认。II.在SYBR Green 实时荧光PCR 方法获得的特异引物的基础上,分别建立了种特异引物PCR(SS-PCR)快速鉴定10 种检疫性实蝇的方法。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一章检疫性实蝇(双翅目:实蝇科)分类鉴定研究概述

1 实蝇的识别

1.1 按实蝇属Anastrepha

1.2 小条实蝇属Ceratitis

1.3 绕实蝇属Rhagoletis

1.4 寡鬃实蝇族Dacini

2 实蝇的经济重要性

2.1 果实蝇属Bactrocera

2.2 小条实蝇属Ceratitis

2.3 按实蝇属Anastrepha

2.4 绕实蝇属Rhagoletis

2.5 寡鬃实蝇属Dacus

3 实蝇的扩散

4 实蝇的分类和鉴定

4.1 分类现状

4.2 实蝇的鉴定

4.2.1 形态学鉴定

4.2.2 分子生物学鉴定

第二章检疫性实蝇mtDNA COI 基因序列比较研

引言

1 材料与方法

1.1 实蝇标本

1.2 实蝇基因组DNA 提取方法

1.2.1 Dneasy Tissue Kit提取方法

1.2.2 基因谷动物组织DNA 提取试剂盒方法

1.3 DNA 质量检查

1.4 目标片断PCR 扩增

1.4.1 PCR 扩增引物和测序引物

1.4.2 PCR 扩增体系

1.4.3 PCR 扩增条件

1.5 实蝇COI 基因序列测定

1.5.1 PCR 产物纯化

1.5.1.1 PCR 产物直接纯化

1.5.1.2 琼脂糖电泳割胶纯

1.5.2 测序

1.6 基因序列比较

2 结果与分析

2.1 DNA 质量检查

2.2 检疫性实蝇mtDNA COI基因序列

2.3 检疫性实蝇同源序列比较分析

2.3.1 COI 基因组成

2.3.2 碱基替换和颠换频率

2.4 遗传距离

2.5 桔小实蝇复合种COI 基因相似度

3 讨论

第三章检疫性实蝇SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定技术研究

引言

1 材料与方法

1.1 实蝇标本

1.2 基因组DNA

1.3 引物设计

1.4 SYBR Green 实时荧光PCR

1.5 溶解曲线分析Melting Curve Analysis

1.6 琼脂凝胶电泳分析Agarose Gel Electriphoresis

1.7 数据分析

2 结果与分析

2.1 辣椒实蝇SYBR Green实时荧光PCR鉴定方法的建立

2.1.1 引物lati-F1/lati-R1特异性验证

2.1.2 SYBR Green 实时荧光PCR 检测灵敏度

2.1.3 SYBR Green实时荧光PCR在实蝇快速鉴定上的应用

2.2 引物capa-F/capa-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定地中海实蝇

2.3 引物bact-F/bact-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定果实蝇亚属

2.3.1 引物docp-F

2.3.2 引物papa-F/papa-R SYBR Green实时荧光PCR鉴定木瓜实蝇

2.3.3 引物camb-F/camb-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定杨桃实蝇

2.3.4 引物phil-F/phil-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定菲律宾实蝇

2.3.5 引物occi-F/occi-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定芒果实蝇

2.3.6 引物corr-L/corr-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定番石榴实蝇

2.4 SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定瓜实蝇和南瓜实蝇

2.4.1 亚属特异引物zeau-F/zeau-R 区分果实蝇亚属和寡鬃实蝇亚属

2.4.2 引物cucu -F/cucu-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定瓜实蝇

2.4.3 引物tau-F/tau-R SYBR Green 实时荧光PCR 鉴定南瓜实蝇

2.5 SYBR Green实时荧光PCR特异引物扩增目标片段与溶解温度关系

3 讨论

第四章检疫性实蝇常规PCR 鉴定技术研究

引言

1 材料与方法

1.1 实蝇标本和DNA基因组

1.2 引物设计

1.3 常规PCR 扩增反应

1.4 琼脂糖凝胶电泳

1.5 PCR 产物序列分析

2 结果与分析

2.1 SS-PCR 鉴定辣椒实蝇

2.1.1 引物特异性验证

2.1.2 SS-PCR 方法的检测灵敏度

2.1.3 SS-PCR 在实蝇快速鉴定上的应用

2.2 SS-PCR 鉴定地中海实蝇

2.3 SS-PCR 鉴定果实蝇亚属实蝇

2.3.1 SS-PCR 鉴定桔小实蝇复合种

2.3.2 SS-PCR 鉴定木瓜实蝇

2.3.3 SS-PCR 鉴定杨桃实蝇

2.3.4 SS-PCR 鉴定菲律宾实蝇

2.3.5 SS-PCR 鉴定芒果实蝇

2.3.6 SS-PCR 鉴定番石榴实蝇

2.4 SS-PCR 鉴定Zeugodacus 亚属

2.4.1 SS-PCR 鉴定瓜实蝇

2.4.2 SS-PCR 鉴定南瓜实蝇

2.5 SS-PCR 产物测序

3 讨论

第五章检疫性实蝇TaqMan MGB 探针实时荧光PCR 鉴定技术研究

引言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 TaqMan MGB 探针和引物设计与合成

1.3 TaqMan MGB 探针实时荧光PCR 扩增反应

1.4 数据分析

1.5 琼脂糖凝胶电泳

2 结果与分析

2.1 TaqMan MGB 探针和引物特异性验证

2.1.1 TaqMan MGB实时荧光PCR方法验证引物lati-F2/lati-R2特异

2.1.2 SYBR Green 实时荧光PCR 方法验证引物lati-F2/lati-R2 特异性

2.1.3 TaqMan MGB 实时荧光PCR 在辣椒实蝇快速鉴定上的应用

2.2 TaqMan MGB 实时荧光PCR 快速鉴定地中海实蝇

2.3 TaqMan MGB 实时荧光PCR 快速鉴定三带实蝇

2.4 TaqMan MGB 实时荧光PCR 快速鉴定瓜实蝇

3 讨论

第六章检疫性实蝇mtDNA COI 基因片段克隆

引言

1 材料与方法

1.1 检疫性实蝇标本

1.2 目标片段常规PCR 扩增

1.3 PCR 产物纯化

1.4 载体连接

1.5 转化

1.6 重组克隆筛选―蓝/白斑筛选

1.7 测序

1.8 克隆片段SYBR Green和TaqMan MGB实时荧光PCR检测

2 结果与分析

2.1 检疫性实蝇mtDNA COI基因片段克隆

2.2 DNA 克隆片段常规PCR 检测

2.3 实蝇克隆片段在快速检疫鉴定上的应用

3 讨论

总讨论

结论

参考文献

附录1 SYBR Green实时荧光PCR和种特异引物PCR产物片段

附录2 TaqMan MGB探针实时荧光PCR产物片段

附录3 本研究建立的分子生物学方法鉴定检疫性实蝇一览表

附录4 本研究科研项目经费资助来源

附录5 在读期间发表论文、会议报告

致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

[1].我国检疫性实蝇分子鉴定技术体系的研究[D]. 姜帆.中国农业大学2015

检疫性实蝇分子生物学快速鉴定技术的研究

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