内皮祖细胞对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管周毛细血管重建的实验研究

论文摘要

背景和目的:慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）是世界范围内的健康问题,最终不可逆地发展为终末期肾衰（end stage renal failure,ESRF）。目前终末期肾衰的临床治疗主要依靠替代治疗或肾移植,但透析治疗病人有着相当高的死亡率和大量并发症,而且由于供体的缺乏及移植后昂贵的免疫抑制剂,肾移植的应用也受到了限制。因此探讨更为有效的慢性肾脏病的防治方法,抑制慢性肾脏病进展和促进肾组织修复已成为肾脏病研究的重要领域。近年研究发现CKD进展的最终共同通路是小管间质纤维化,CKD患者肾功能不全更大程度上与小管间质纤维化程度相关。大量的研究证实肾小管周毛細血管的丢失和低氧是小管间质损伤纤维化的最终共同通路,而前者是低氧的主要原因之一。低氧导致肾实质细胞凋亡,并促进致纤维化因子、炎症因子等分泌。还有研究发现血管损伤最易导致血管周细胞移动和分化成肌成纤维细胞,提出对纤维化的研究重点应该是血管,而不仅仅是上皮细胞。故通过改善肾小管周微血管的密度,改善缺氧,延缓甚至逆转CKD的进展具有重要意义。血管的生成一般认为是通过成熟内皮细胞增生、移动,以出芽方式完成,称为血管生成（angiogenesis）,而另外还有一种生成血管的机制是通过内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）分化形成血管,称为血管发生（vasculogenesis）。后者通常被认为仅仅存在于胚胎血管形成。自从1997年Asahara及同事成功分离出外周血中EPCs后,这种观点已得到改变。EPCs是一类能循环、增殖并分化为血管内皮细胞,但尚未表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成血管的前体细胞。EPCs在心脑血管和外周血管重建方面得到了广泛的研究。研究发现内皮祖细胞不仅能直接增殖、分化为内皮细胞,参与形成新的血管结构,还能分泌许多生长因子,如血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,bFGF）;分泌一些生物活性物质如NO,影响内皮功能;通过自分泌和旁分泌的方式参与内皮修复。可见,内皮祖细胞在成体参与血管修复过程中是以一种类似于胚胎血管发生的方式进行,强调了细胞因子和细胞的协同作用,因而形成更加完整成熟的血管。已有的研究发现在CKD早在第1期就存在EPCs数量和功能的减少,而肾移植后有所改善,还有研究发现骨髓源的EPCs能修复肾小球毛细血管。既然CKD存在EPCs数量和功能的减少,那么通过EPCs移植是否就能重建肾小管周毛细血管,从而改善由于低氧导致的CKD进行性恶化呢?其可能的机制又如何呢?为此,本研究首先在体外观察了低氧刺激肾小管上皮细胞的条件培养液对体外扩增的EPCs增殖、迁移和分泌血管生成因子的影响;然后在动物体内观察了EPCs移植对单侧输尿管梗阻大鼠的肾小管周毛细血管密度和小管间质纤维化的改善和可能的机制;作为参与缺血诱导EPCs动员的最重要和最终的趋化因子――基质细胞衍生因子（Stromal cell derived factor-1,SDF-1）是否也参与了EPCs在肾间质的归巢。方法:本课题第一部分采用内皮祖细胞选择性培养基培养和诱导分化密度梯度离心法获得的大鼠骨髓源性单个核细胞,以获得大鼠骨髓源性EPCs,并通过摄取acLDL-DiI和结合FITC-lectin荧光双染、免疫荧光检测细胞表面干细胞抗原及内皮细胞特异性抗原鉴定。采用组织块贴壁法培养大鼠肾小管上皮细胞,低氧处理肾小管上皮细胞后获得条件培养液（Conditioned medium,CM）,常氧处理后获得的条件培养液作为对照组,采用逆转录多聚酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）和western blot检测低氧刺激后肾小管上皮细胞SDF-1和VEGF的表达。经CM处理大鼠骨髓源EPCs后,采用MTT分析其增殖、迁移能力,采用RT-PCR和Western blot检测CM作用后EPCs分泌VEGF、血管生成素-1（angiogenin-1,Ang-1）,表达C-X-C家族趋化因子受体（C-X-C chemokine receptor, CXCR4）的变化。本课题第二部分采用单侧输尿管梗阻（unilateral reteral obstruction,UUO）间质纤维化模型,体外扩增并标记EPCs后移植。分组如下:1.假手术对照组（Sham operation group）:简称为Sham组,n=15只。手术入路方式同UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。术中经左肾动脉注射0.01mol/L PBS 1ml。2.移植对照组（transplantation control group）:简称sham+EPCs组,n=15只。手术入路方式同UUO组,进腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。术中经左肾动脉注射0.01mol/L PBS 1ml稀释EPCs107个。3.单侧输尿管梗阻组（Ulateral ureteral obstruction group）:简称为UUO组, n= 15只。大鼠行左侧输尿管结扎术。术中经左肾动脉注射0.01mol/L PBS 1ml。4.移植组（ Transplantation group）:UUO+EPCs, n=15只。大鼠行左侧输尿管结扎术,术中经左肾动脉注射0.01mol/L PBS 1ml稀释的同窝来源EPCs107个。7d,14d,21d,每组随机抽取5只动物处死,采集尿液、血液及肾脏组织标本,观察不同时间点以下指标的变化:①检测肾重/体重、24小时尿蛋白定量以及血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、尿素氮、肌酐水平。②HE、PAS和Masson染色后在光镜下观察肾组织形态改变,并进行小管间质病变的病理损害积分。③免疫组织化学检测肾小管周毛细血管密度（JG12）和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen ,PCNA）、SDF-1、VEGF、α-SMA、HIF-1α的表达,采用western blot检测SDF-1、VEGF和HIF-1α、Ang-1的表达。④采用荧光双染对移植细胞定位,免疫荧光法检测移植细胞的半定量。结果:第一部分:内皮祖细胞条件培养液诱导培养的大鼠骨髓单个核细胞在7～10天呈梭形或纺锤形,类似于内皮细胞,绝大多数细胞可摄取acLDL-DiI,能结合FITC-lectin,免疫荧光检测到既有干细胞抗原CD133、CD34,又有内皮细胞特异性标志物VEGFR-2表达。组织块贴壁法培养肾小管上皮细胞,在贴壁后24～48h肾小管节段周有上皮样细胞长出,6～7天铺满瓶底,形态为多边鹅卵石样,免疫荧光角蛋白染色阳性。低氧作用肾小管上皮细胞48h后SDF-1和VEGF表达均有增加,5%氧浓度增加最为明显。CM刺激EPCs后,EPCs增殖、迁移能力增强（P<0.05）,VEGF、Ang-1和CXCR4表达显著强于对照组（P<0.05）。第二部分:成功构建了大鼠UUO模型,随梗阻时间延长,梗阻侧肾脏体积逐渐增大,肾盂内积液增加,肾实质变薄,镜下第7天可见明显的肾小管扩张、上皮细胞空泡变性、间质炎性细胞浸润;第14天肾小管扩张更加明显,上皮细胞有萎缩,有纤维化形成;第21天仍可见明显扩张的肾小管,上皮细胞变性萎缩和炎细胞浸润更加明显,纤维化面积更广,肾小管基底膜增厚,整个过程肾小球病变均不明显。EPCs移植后肝功、肾功、24h尿蛋白与UUO组、假手术组无显著性差异;移植组与UUO组比肾脏病理积分显著降低（p<0.05）;与假手术组比,UUO组α-SMA在14天、21天显著增加（P<0.05）,移植组α-SMA在14天、21天显著低于UUO组（P<0.05）;在14天和21天UUO组肾小管周毛细血管密度低于移植组（P<0.05）;免疫荧光双染存在JG12和BrdU双阳性细胞,移植7d梗阻肾脏BrdU阳性细胞最明显,随后逐渐下降,21d仍有表达,显著高于移植对照组;与假手术组比,UUO组SDF-1表达在第7天显著增加（P<0.05）,随后降低,21天与假手术组比无显著性差异,移植组各时相点SDF-1表达均强于假手术组,并高于同期UUO组;与假手术组比UUO、移植组Ang-1、VEGF表达第7天显著增加,随后迅速下降,而移植组各时相点均高于同期UUO组（P<0.05）;假手术组仅有少量HIF表达,且主要表达在胞浆,UUO组HIF表达随病程进展逐渐增加,显著高于假手术组（p<0.05）,移植后HIF表达降低,显著低于UUO组（P<0.05）;在假手术组肾间质仅见少量PCNA表达,UUO组各时相点间质PCNA显著高于假手术组,随病程延长逐渐降低,移植后间质PCNA表达低于UUO组。结论:1.采用内皮祖细胞选择性培养液培养和诱导分化密度梯度离心法获得的骨髓单个核细胞,成功培养出了大鼠骨髓内皮祖细胞。2.采用组织块贴壁法,成功培养了肾小管上皮细胞。3.低氧作用下肾小管上皮细胞VEGF和SDF-1表达增加;低氧作用肾小管的条件培养液（CM）促进内皮祖细胞增殖、迁移和VEGF、Ang-1、CXCR4表达,提示CM通过VEGF和SDF-1促进了内皮祖细胞的增殖、迁移、生存和成血管能力。4.EPCs移植改善了UUO大鼠梗阻肾脏的肾小管周毛细血管密度和小管间质损伤;5.UUO大鼠有SDF-1表达,提示其能促进EPCs归巢,归巢的EPCs参与了间质血管的重建;6.EPCs移植后UUO肾脏VEGF、Ang-1表达增加,EPCs不仅直接参与血管的重建,还通过其自分泌和旁分泌机制促进血管重建。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 正文 内皮祖细胞对单侧输尿管梗阻大鼠肾小管周毛细血管重建的实验研究
• 前言
• 第一部分 低氧作用下肾小管上皮细胞对大鼠骨髓内皮祖细胞的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 第二部分 大鼠骨髓内皮祖细胞移植对UUO 大鼠肾小管周毛细血管重建及肾脏损伤修复的研究
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 全文结论
• 致谢
• 照片
• 参考文献
• 文献综述 内皮祖细胞与肾脏病
• 参考文献
• 攻读博士期间发表论文
• 英文论著