湖北省牛瑟氏泰勒虫的分子进化分析及分子iELISA诊断方法的建立

论文摘要

牛瑟氏泰勒虫病是由顶复门的泰勒科（Theileriidae）、泰勒属（Theileria）的蜱传性血液原虫寄生于牛的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内所引起的以高热稽留、贫血、消瘦和体表淋巴结肿大为主要临床症状的一种血液性原虫病。该病在我国许多省份均有发生和流行,给畜牧业的发展造成了巨大的经济损失。本研究首先克隆了湖北省五个不同地理株的p33基因序列和三个不同地理株的p23基因序列。利用p33基因序列进行了分子进化分析,随后进行了p33、p23基因的原核表达并利用所表达的p33、p23融合蛋白作诊断抗原建立了牛T.sergenti病的分子间接ELISA诊断方法。（1） T.sergenti不同地理株的分子进化分析利用设计的泰勒虫p33基因引物扩增了湖北省五个不同地理株泰勒虫的p33基因,克隆测序结果表明该基因完整读码框（ORF）为852bp或855bp,可编码283或284个氨基酸。将其基因序列与GenBank上所公布的20种其它相关序列进行比较分析并建立了系统发育树。结果表明,本实验室分离得到的一株武昌-1株泰勒虫与越南未定种泰勒虫独立于一个分枝上,与其它各种泰勒虫株的进化距离均较远,结合该泰勒虫18SrRNA的进化分析结果和致病性等特点,初步推测该虫株可能为一泰勒虫新种;而其它4株泰勒虫均与日本Marula株（Tpye A,MPSP-3）的水牛泰勒虫的进化距离较近,因此可把它们归入MPSP-3型或其亚型。（2）瑟氏泰勒虫p33和p23基因的原核表达将克隆得到的T.sergenti p33和p23的全长ORF基因,分别插入到原核表达载体pGEX-KG和pET-28a,先后构建了其对应的原核表达质粒即,pGEX-KG-p33、pGEX-KG-p23及pET-28a-p33、pET-28a-p23,并均在宿主菌E.coli BL21-CodonPlus中实现了稳定表达,表达产物经Western-blot检测分析,结果表明原核表达的p33、p23蛋白均具有较好的免疫反应原性。（3）瑟氏泰勒虫p33间接ELISA和p23间接ELISA诊断方法的建立首先用GST-p33、GST-p23作诊断抗原建立牛T.sergenti病的间接ELISA方法,结果发现,GST标签蛋白的存在使该方法无法区分牛瑟氏泰勒虫和牛日本血吸虫,随后换用His-p33和His-p23两种融合蛋白为诊断抗原,重新建立了牛T.sergenti病的间接ELISA方法。结果显示,两蛋白间接ELISA的阴阳性符合率及总符合率均为100%。这两种ELISA方法检测牛巴贝斯虫病原体的阳性血清时结果全为阴性;阻断试验结果显示当血清稀释度为1:100时,可达到完全阻断效果;诊断试剂的板内、板间重复试验,其变异系数＜10%;敏感性试验结果中,两种ELISA方法均能检测到1:6400以上稀释血清中的抗T.sergenti的特异性抗体;两种诊断试剂盒在37℃、25℃贮存条件下的保质期均可达到8d,相当于-20℃贮存条件下的8个月;以上结果表明,利用6His-p33、6His-p23两种融合蛋白所建立的p33-ELISA和p23-ELISA诊断方法均具有较好的特异性、敏感性、稳定性、较长的保质期及良好的阻断效果。（4）湖北省牛瑟氏泰勒虫病的血清学流行病学调查利用所建立的p33-ELISA和p23-ELISA对来自湖北省8个地区共计178头份临床牛血清样品进行了检测,其阳性检出率为27.53%,与泰勒虫特异性PCR诊断方法进行比较,所建立的ELISA方法的阳性检出率高于PCR的阳性检出率（21.91%）,二者的阴阳性符合率分别为87.05%、82.05%,总符合率为85.96%。本研究利用泰勒虫p33基因对湖北地区的五株T.sergenti分离株进行了分子进化研究,该结果为进一步进行泰勒虫的分类学研究提供了又一证据。利用p33、p23的原核表达产物建立的两种ELISA诊断方法,对牛泰勒虫病的临床检测、血清流行病学调查等具有重要意义,为牛泰勒虫病的免疫诊断和预防控制打下了基础。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 国内外牛泰勒虫病的研究进展
• 1.1 牛泰勒虫病的病原学
• 1.1.1 病原的分类
• 1.1.2 泰勒虫形态学及超微结构
• 1.1.3 泰勒虫的核酸组成特点
• 1.1.4 泰勒虫主要的抗原分子
• 1.2 流行病学
• 1.2.1 泰勒虫病的传播媒介蜱
• 1.2.2 泰勒虫病的流行情况
• 1.3.诊断方法
• 1.3.1 病原学诊断
• 1.3.2 血清学诊断
• 1.4 预防措施
• 1.4.1 药物预防
• 1.4.2 免疫预防
• 第二章 牛瑟氏泰勒虫p33/p23基因的克隆及分子进化分析
• 2.1 研究的目的意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 试验方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 牛瑟氏泰勒虫p33/p23基因的PCR扩增、克隆及序列测定
• 2.3.2 五株泰勒虫的p33基因序列与其相关序列的比较分析及系统发生树的建立
• 2.3.3 p33、p23两蛋白抗原性及等电点的预测
• 2.4 讨论
• 第三章 牛瑟氏泰勒虫p33/p23基因的原核表达
• 3.1 研究的目的意义
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 质粒与菌株
• 3.2.2 主要药品及试剂
• 3.2.3 主要试剂及溶液的配制
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 重组表达质粒的构建及鉴定
• 3.3.2 重组表达质粒在BL21-CodonPlus中的诱导表达
• 3.3.3 最佳诱导表达条件的确定
• 3.3.4 表达产物存在形式的检测
• 3.3.5 可溶性表达产物的提取
• 3.3.6 不溶性表达产物（包涵体）的提取和复性
• 3.3.7 SDS-PAGE电泳
• 3.3.8 Western-blot试验
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 pGEX-KG-p33与pGEX-KG-p23重组表达质粒的构建及原核表达
• 3.4.2 pET-28a-p33与pET-28a-p23两种重组表达质粒的构建及原核表达
• 第四章 牛泰勒虫病分子间接ELISA诊断方法的建立及初步应用
• 4.1 研究的目的意义
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.2 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 酶标反应板均一性的测定
• 4.2.2 GST-p33和GST-p23两种融合蛋白ELISA方法的建立
• 4.2.3 His-p33和His-p23分子间接ELISA诊断方法的建立
• 4.2.4 间接ELISA的特异性试验
• 4.2.5 His-p33/p23间接ELISA的重复性检测
• 4.2.6 His-p33/p23间接ELISA敏感性试验
• 4.2.7 His-p33间接ELISA和His-p23间接ELISA检测牛体内瑟氏泰勒虫特异性抗体的水平
• 4.2.8 His-p33和His-p23包被ELISA板的保质期试验
• 4.2.9 His-p33和His-p23两种蛋白间接ELISA方法的临床初步应用
• 4.2.10 His-p33、His-p23两种蛋白单独包被的ELISA与两种蛋白混合后包被进行ELISA试验的比较
• 4.2.11 His-p33间接ELISA/His-p23间接ELISA方法与本实验室所建立的牛泰勒虫特异性PCR诊断方法的比较
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录1