新型CD20抗体的设计及生物学功能研究

论文摘要

非霍奇金淋巴瘤（Non Hodgkin’s lymphoma, NHL）是临床最常见的淋巴系统恶性肿瘤,其中B细胞来源的约占85%,好发于青壮年,发病率和死亡率呈逐年上升趋势。近年来,单克隆抗体及靶向治疗NHL的临床试验研究取得了重大进展,其中被广泛使用且富有成效的是抗CD20的单克隆抗体药物。CD20分子是一种B细胞分化抗原,仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面。它在95%以上的B细胞淋巴瘤中表达,而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织中不表达。因此,CD20分子是治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。Rituxan （Rituximab, C2B8）为美国Genetech公司研制的以人CD20分子为靶点的嵌合基因工程抗体,已于1997年11月获美国FDA批准上市,用于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤的临床治疗。Rituximab在与B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20抗原结合后,通过何种机制及途径破坏和清除肿瘤细胞,是人们长期以来一直关注的问题。前期的研究表明抗CD20单克隆抗体可能的作用机制主要包括:1)补体依赖的细胞毒作用（CDC）;2)抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）;3)诱导细胞凋亡。目前,对于抗CD20抗体主要通过何种机制发挥抗肿瘤作用仍然存在争议。因此,在本研究中我们采用计算机辅助设计的方法在Rituximab抗体的互补决定域（CDR）进行虚拟突变,然后采用蒙特卡罗模拟退火的方式寻找这些抗体突变体与CD20抗原肽可能的结合模式。最终,采用MM-PBSA的方法进行Rituximab突变体与CD20短肽的亲和力预测。我们将通过虚拟突变的具有不同亲和力的Rituximab突变体进行体外分子生物学实验,构建这些Rituximab抗体突变体的基因序列。然后,通过瞬转CHO细胞进行Rituximab抗体突变体的表达。最终,通过流式细胞术检测其与细胞的结合实验,利用竞争性ELISA和SPR进行抗体突变体亲和力的鉴定工作。在获得不同亲和力的Rituximab抗体突变体以后,我们分别对这些抗体突变体的CDC、ADCC和诱导细胞凋亡作用一一进行检测,进而研究Rituximab突变体的亲和力与CDC、ADCC和诱导细胞凋亡这些肿瘤杀伤机制之间的关系。我们的实验数据表明,提高Rituximab抗体的亲和力能够提高其ADCC作用,但是对CDC和诱导细胞凋亡作用没有影响。有趣的是,在这些抗体突变体中我们鉴定出了一个三点组合突变体（triple variant）,与野生型Rituximab抗体相比能够显著提高诱导细胞凋亡的能力。通过体内外实验证明,这个三点组合突变体具有良好的肿瘤杀伤效果,甚至对Rituximab耐受的细胞仍然具有良好的治疗作用。通过进一步的机制探讨,我们发现II型抗CD20抗体诱导的非caspase依赖的凋亡为一种溶酶体途径依赖的凋亡。我们的实验数据表明,这个三点组合突变体可作为一种潜在的抗CD20的抗体药物应用于临床。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 前言
• 第一部分 计算机辅助设计提高Rituximab 的抗体亲和力
• 一、Rituximab 抗体突变抗体的虚拟筛选
• （一） Rituximab 抗体突变体的虚拟突变
• （二） 对突变后的结构采用计算机模拟的方法进行构象搜索
• （三） 对优化结构进行综合评价
• 二、Rituximab 突变体的构建及亲和力鉴定
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• 参考文献
• 第二部分 不同亲和力的Rituximab 突变体生物活性的鉴定
• 一、Rituximab 及其突变体的ADCC 活性鉴定
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 二、Rituximab 及其突变体的CDC 活性鉴定
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 三、Rituximab 及其突变体的诱导细胞凋亡活性检测
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 四、Rituximab 及其突变体的体内保护活性
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 参考文献
• 第三部分 Triple variant 对Rituximab 抵制肿瘤细胞的杀伤
• 一、Rituximab 抵制细胞株的建立
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 二、Triple variant 对Rituximab 抵制细胞的体内杀伤
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 参考文献
• 第四部分 II 型CD20 抗体诱导非caspase 依赖凋亡的研究
• 一、II 型CD20 抗体的构建
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 二、II 型CD20 抗体凋亡信号通路分析
• （一） 材料和方法
• （二） 实验结果
• （三） 讨论
• 综述 肿瘤标志物
• 参考文献
• 在读期间发表论文及参加科研工作情况
• 致谢