叶卷曲基因调控机制的研究

论文题目: 叶卷曲基因调控机制的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 余琳

导师: 何玉科

关键词: 大白菜,拟南芥,基因,基因,突变体,极性,激素,双链,结合结构域,叶卷曲,叶球

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 叶的极性建立直接决定了叶的平展性(Flatness)发育。极性改变会破坏大多数植物叶的平展性,影响植物体的光和作用、蒸腾作用和抗逆性等生理功能。与此同时,叶的卷曲对一些作物来说是一种非常有用的农艺性状。大白菜、甘蓝和抱子甘蓝等蔬菜作物的可食用器官是叶球,这些叶球的发育过程表现为叶片向上向内卷曲。了解叶极性或叶卷曲发生的遗传规律,揭示这一重要过程的基因调控机制,对于遗传上控制叶的姿态和形态,发展叶发育的重要理论,改良叶平展度或卷曲度等遗传性状,提高农作物产量和品质有重要的理论意义和实用价值。早在1996 年,我们实验室利用差异杂交的方法在大白菜中分离和克隆了双链RNA 结合蛋白基因BcpLH,并初步发现它与叶卷曲的发生相关(Yu 等,2000)。本项研究将综合国内外近年来叶极性和叶卷曲发生方面的最新进展,利用大白菜BcpLH 基因和模式植物拟南芥同源基因HYL1,通过比较生物学的方法探讨叶卷曲发生的基因调控机制。首先,我们选择了拟南芥hyl1 突变体(Lu 和Fedoroff, 2000)为实验材料,通过对其叶脉模式和近远轴极性等叶发育相关性状的观察,探讨HYL1 基因对叶卷曲发生调控的可能机制。和野生型相比,hyl1 突变体具有向上卷曲(偏下性生长)的叶片特征,次级叶脉的复杂度降低而且常常出现断裂的现象。在hyl1 突变体叶卷曲发生突出的侧部区域,叶肉细胞的近远轴极性丧失,表现出栅栏细胞和海绵细胞的混乱。但表皮细胞的近远轴极性并没有改变,而只是远轴面的细胞数目减少,细胞面积变大。然后,我们构建了HYL1 启动子和GUS 报告基因融合的植物表达载体,浸花法转化拟南芥,分析了pHYL1::GUS 转基因植株中GUS 的活性。结果表明,其启动子的表达还是有特异性的,我们在真叶、叶柄和脉络系统中都能检测到GUS 的活性,并随着叶片的展开和成熟,表达部位从整片叶子缩小到叶片的基部。在转基因茎生叶中的表达趋势和莲座叶一致,在花蕾中主要在萼片和雄蕊中表达;开花后,GUS 活性局限在花托和花柄的交界及雄蕊中表达,角果幼胚中也能检测到GUS 活性。利用半定量RT-PCR 和原位杂交的方法,对REV 和FIL 基因的表达方式进

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一部分:文献综述

文献综述I:叶卷曲发生的分子机制

一、叶卷曲突变体

二、叶卷曲发生的可能机制

(一) 基因控制

(1) 细胞的分裂和生长的基因调控

(2) 细胞分化导致极性产生的基因调控

(3) AGAMOUS 基因的异位表达

(二) 激素控制

(三) 环境控制

三、结束语

参考文献

文献综述II:microRNA 在植物侧生器官极性建立过程中的调控作用

一、植物侧生器官的极性建立

二、植物中miRNAs 的产生和成熟

三、miRNA 与植物器官的极性建立

四、结束语

参考文献

第二部分:研究论文

第一章 HYL1 基因与拟南芥叶卷曲的发生

引言

一、材料和方法

(一) 质粒和菌株

(二) 植物材料

(三) 试剂和引物

(四) 方法

(1) 植物材料的种植

(2) 叶相关系数的统计

(3) 扫描电镜

(4) 石蜡切片植物组织观察

(5) 暗视野显微镜样品制备及观察

(6) CTAB 法植物组织总DNA 的提取植物材料的种植

(7) 质粒的提取

(8) HYL1 基因启动子的分离及pHYL1::GUS 融合基因载体的构建

(9) 热激法大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

(10) 冻融法农杆菌感受态细胞的制备及转化

(11) 浸花法转化拟南芥及筛选

(12) TPS 法小量提取植物组织DNA

(13) 组织化学染色法(GUS 活性检测)

(14) 植物组织总RNA 提取

(15) 半定量RT-PCR

(16) microRNA northern 杂交

(17) 原位杂交探针的构建

(18) 原位杂交

二、结果分析

(一) hy11 突变体叶片相关表型的进一步观察和分析

(二) hy11 突变体的叶脉简化

(三) hy11 突变体叶片极性的部分改变

(四) HYL1 基因与miRNA 和叶极性决定基因的相互关系

(五) HYL1 基因启动子的表达特征

三、讨论

(一) hy11 的叶片在横向和纵向表现出不同的卷曲程度

(二) HYL1 调控叶脉和叶极性的正常发育

参考文献

第二章 HYL1 蛋白不同结构域的生物学功能

引言

一、材料和方法

(一) 质粒和菌株

(二) 植物材料

(三) 试剂和引物

(四) 方法

(1) 植物材料的种植

(2) HYL1 基因缺失片断的扩增及双元载体的构建

(3) 浸花法转化拟南芥及筛选

(4) 半定量RT-PCR 鉴定外源基因的表达

(5) 不同转基因拟南芥中miR165 和miR160 的Northern 杂交

(6) 转基因植株叶卷表型的观察及对不同外源激素的反应分析

二、结果分析

(一) HYL1 基因缺失片断的构建及转基因植株的表型观察

(二) HYL1 基因缺失片断转基因植株对不同激素的生理反应

(三) HYL1 基因缺失片断转基因植株的miRNA 累积

三、讨论

(一) HYL1 蛋白在体内的生物学功能主要由其两个DSRM 结构域完成

(二) HYL1 对叶平展的调控和对激素的反应是由miRNA 介导的

参考文献

第三章大白菜中BcpLH 基因的生物学功能

引言

一、材料和方法

(一) 质粒和菌株

(二) 植物材料

(三) 试剂和引物

(四) 方法

(1) 植物材料的种植

(2) BcpLH 基因缺失片断的扩增及双元载体的构建

(3) BcpLH-GFP 融合载体构建及亚细胞定位

(4) 浸花法转化拟南芥及筛选

(5) 真空抽滤法转化大白菜及筛选

(6) 转基因植株叶卷曲表型的观察及对不同外源激素的反应分析

(7) miR165 和miR160 的Northern 杂交

(8) 半定量RT-PCR

(9) 实时定量PCR

(10) 组织切片

二、结果分析

(一) 大白菜BcpLH 基因与拟南芥HYL1 基因的功能一致

(二) BcpLH 基因定位在核中

(三) 结球型大白菜不同时期叶片组织的切片观察

(四) 结球型大白菜和散叶型大白菜结球期顶端组织的切片观察

(五) BcpLH 基因不同时期的表达分析

(六) 转基因大白菜的获得及分子鉴定

(七) 正义和反义BcpLH 转基因大白菜的表型观察

三、讨论

参考文献

论文发表情况

致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

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