论文摘要
1、目的:基因治疗在整形外科领域很有前景,目前涉及的研究方向包括:创伤修复、皮瓣保存、组织工程等。基因治疗成功的关键之一在于选取一种合适的载体,把目的基因导入靶细胞,使其有效、稳定、特异地表达。病毒载体转染效率很高,因此在基因治疗临床试验中应用得相当广泛。回顾文献,发现在数种病毒载体中,慢病毒（LV）载体的优势比较明显,包括:①可以转染分裂细胞和非分裂细胞;②转染效率高;③能长期稳定表达;④可供插入的目的基因较大。目前以慢病毒载体为工具在整形领域进行的相关研究还很少。因此,研究慢病毒载体的相关特性,尤其是应用慢病毒载体转染整形外科领域相关细胞的基础研究是很有意义的。考虑到皮肤组织在整形外科领域的特殊地位,本实验选取皮肤结构中几种常见细胞为研究对象,用慢病毒载体转染这些细胞,以探究慢病毒载体转染合适的条件、转染效率及转染对细胞活力的影响等问题。2、方法:培养3种细胞:脂肪前体细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞,分3部分进行实验。1)用MOI（感染复数）=10,20,50,100的LV-eGFP（携带绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体）转染上述细胞;转染后1周内于荧光显微镜下观察GFP表达情况,从而判断慢病毒载体转染目的细胞所需的合适MOI值及GFP表达时间等;此外,还比较了加polybrene组与不加polybrene组之间GFP表达的差异;2)在确定了慢病毒载体转染目的细胞合适的MOI值后,以此条件进行目的细胞转染,在转染后不同时间,通过FACS（荧光激活细胞分选术）检测转染效率;3)设置转染组及对照组,分别以MTT（甲基噻唑基四唑）法及台盼蓝染色活细胞计数法来检测两组之间细胞活力的差别,以探讨慢病毒载体转染对目的细胞活力的影响。3、结果:1)荧光显微镜观察结果:a)对于实验中的3种细胞,GFP表达随MOI值的增大而变强。其中MOI=20时GFP表达已比较满意。b)总体上,LV-eGFP转染细胞4天后GFP表达已接近高峰。c)加polybrene组GFP表达要好于未加polybrene组,对于脂肪前体细胞和血管内皮细胞尤为明显。2)FACS检测结果:转染后4天,3种细胞的转染效率都在50%以上,1周时效率较4天时变化不大,3周时转染效率仍比较高。3)MTT法、台盼蓝染色细胞计数结果:经统计分析,转染组与对照组之间,细胞的活力无明显差别。4、结论:通过本实验掌握了慢病毒载体转染目的细胞相关的实验方法。对于本实验的3种细胞,MOI=20比较合适,已能实现有效转染;转染后4天GFP表达已接近高峰;polybrene对转染有增强作用。另外,经FACS检测,认为慢病毒的转染效率是比较高的,而且目的基因的表达能持续较长时间。最后,本实验证实了慢病毒载体转染对于目的细胞的活力无明显影响。