猪FBXO8基因结构及功能的初步研究

论文摘要

猪的遗传改良一直是养猪业界科技工作者关注的重点,传统育种手段在猪的品种改良方面取得了显著成效。随着生命科学技术的发展,尤其是分子生物学领域的不断突破,分子育种将成为猪遗传改良的重要手段。任何经济性状的形成都是受复杂的遗传调控。蛋白质是生命活动的具体执行者,泛素—蛋白酶体途径是一种重要的蛋白质降解系统,是调节细胞内蛋白质水平的重要机制。通过降解许多诸如细胞周期因子、转录因子等蛋白,从而参与调节许多重要的生命活动。泛素蛋白酶体途径最主要的特征就是底物的多样性和选择性,而这一功能主要是由泛素—蛋白连接酶E3s的F-box基序直接决定的。本研究利用生物信息学与分子生物学技术相结合的方法,克隆获得了猪F-box家族的FBXO8基因,初步取得了如下结果:1.利用网络数据库的信息,通过生物信息学手段,电子克隆到猪FBXO8基因的编码序列并对其进行了系统的生物信息学研究。2.结合猪EST数据库的信息,分离并鉴定了猪FBXO8的功能序列。3.用RT-PCR的方法,对猪FBXO8基因进行了组织表达谱分析。结果发现这个基因在所检测的成年五指山猪16个组织中有8个组织有不同程度的表达。4.使用pEGFP-N1载体构建了人源、猪FBXO8的亚细胞定位载体。在人肺腺癌细胞系（A549）、猪肾细胞（PK15）上分别进行了人、猪亚细胞定位的研究。由人源FBXO8的亚细胞定位显示,FBXO8主要分布在细胞质中。5.构建了猪pcDNA-3.1—FBXO8过表达载体,通过转染猪肾细胞（PK15）,并提取转染后的32小时细胞RNA,利用用RT-PCR验证了过表达水平,为后续的细胞生物学功能研究奠定了基础。6.成功构建了猪FBXO8原核表达载体,对猪FBXO8蛋白水平的功能进行了初步的研究,为后续的研究打下了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1. 文献综述
• 1.1 泛素—蛋白酶体途径研究简介
• 1.2 泛素—蛋白酶体途径的组成
• 1.2.1 泛素（ubiquitin,Ub）
• 1.2.2 泛素活化酶（ubiquitin-activating enzyme,E1）
• 1.2.3 泛素结合酶（ubiquitin-conjugating enzymes,E2 s）
• 1.2.4 泛素—蛋白连接酶（ubiquitin-protein ligases,E3 s）
• 1.2.5 泛素链延长辅助酶E4 s
• 1.2.6 26S蛋白酶体
• 1.2.7 泛素解离酶（DUB s）
• 1.3 泛素—蛋白酶体途径对蛋白质降解的作用机制与调节
• 1.3.1 泛素蛋白酶体途径对蛋白质的降解机理
• 1.3.2 泛素化调节和去泛素化调节
• 1.4 泛素—蛋白酶体途径的功能
• 1.4.1 泛素—蛋白酶体途径参与的生理过程
• 1.4.2 泛素—蛋白酶体途径与疾病
• 1.4.3 泛素—蛋白酶体系统与肉质
• 1.5 泛素—蛋白连接酶E3 s
• 1.5.1 泛素—蛋白连接酶E3 s的分类
• 1.5.2 E3 s与泛素化
• 1.6 F-box蛋白家族
• 1.6.1 F-box蛋白家族简介
• 1.6.2 F-box蛋白的结构特征
• 1.6.3 F-box蛋白的功能与参与的生理过程
• 1.6.4 F-box蛋白的调控
• 1.7 FBXO8蛋白与ARF
• 1.7.1 ARF的研究历程
• 1.7.2 ARF的分类与结构
• 1.7.3 ARF参与的生理活动
• 1.7.4 ARF的激活
• 2.研究的目的和意义
• 3.材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 DNA样品
• 3.1.2 组织样品
• 3.1.3 载体、菌株和细胞系
• 3.1.4 试剂盒、酶及血清
• 3.1.5 主要试剂
• 3.1.6 主要试剂的配制
• 3.1.7 主要仪器
• 3.1.8 主要分子生物学软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 猪FBXO8基因克隆
• 3.2.2 猪FBXO8基因表达谱分析
• 3.2.3 猪FBXO8基因蛋白序列比对及进化树绘制
• 3.2.4 猪FBXO8基因多态性（SNP）预测
• 3.2.5 细胞总RNA的提取和反转录
• 3.2.6 原核表达
• 3.2.7 真核表达
• 3.2.8 细胞培养和转染
• 4.结果与分析
• 4.1 FBXO8基因的克隆与序列分析
• 4.2 FBXO8基因的结构域分析
• 4.3 FBXO8基因的修饰位点和亚细胞分布预测
• 4.4 FBXO8基因的进化分析
• 4.5 FBXO8基因的表达特征分析
• 4.6 猪FBXO8基因组织表达谱分析结果
• 4.7 猪FBXO8基因多态性
• 4.8 FBXO8人同源基因亚细胞定位结果:
• 4.8.1 空载体pEGFP-N1亚细胞定位结果
• 4.8.2 人FBXO8蛋白质亚细胞定位结果
• 4.9 猪FBXO8基因过表达
• 4.9.1 真核表达载体的双酶切验证
• 4.9.2 pcDNA3.1（+）-FBXO8过表达前后细胞形态
• 4.9.3 细胞总RNA提取及RT-PCR
• 4.10 猪FBXO8基因的原核表达
• 4.10.1 原核表达载体的双酶切验证
• 4.10.2 原核表达SDS-PAGE结果
• 5.讨论
• 5.1 猪FBXO8基因的表达
• 5.2 猪FBXO8基因的多态性
• 5.3 亚细胞定位
• 5.4 真核表达
• 5.5 原核表达
• 6.小结
• 6.1 本研究获得的结果
• 6.2 本研究的创新性
• 6.3 本研究的不足之处
• 6.4 下一步的工作计划
• 参考文献
• 致谢