链霉菌麦芽糖转糖基酶基因的克隆、原核表达及其产酶研究

论文摘要

环状糊精是淀粉经酶降解环化而成的具有筒状疏水内腔的产物,合成大环糊精的酶有麦芽糖转糖基酶。由于其在生物体内的含量很低,无论作为研究来源还是用于制备大环糊精,都不能满足实际需求。本文从Streptomyces ssp. ST66中扩增到麦芽糖转糖基酶（Mal Q）基因,构建了一株基因工程菌E.coli BL21/ pET-GST-Mal Q,并成功得到表达。对表达产物进行了初步分离纯化,并催化直链淀粉合成大环糊精。研究了影响基因工程菌发酵产酶相关因素,主要结论如下:（1）用PCR方法扩增Streptomyces ssp. ST66 Mal Q基因,将该基因插入原核表达载体pET-GST中,测序后发现开放阅读框（ORF）全长2133 bp,编码711个氨基酸,分子量为76.56 kDa。在GenBank中经BLAST比对,与报道的Streptomyces coelicolor Mal Q基因同源性高达97%。重组质粒转化E.coli BL21,构建基因工程菌E.coli BL21/pET-GST-Mal Q,经IPTG诱导表达目的蛋白。离心收集离心收集并利用超声波破碎细胞,将细胞破碎液进行SDS-PAGE电泳,结果表明Mal Q基因成功得到表达,且表达产物属于胞内酶；将粗酶液作用于麦芽二糖,反应液经薄层色谱分析,证实粗酶液具有麦芽糖转糖基活性。（2）通过亲和色谱,纯化得到目标蛋白。使用人鼻病毒14亚型3C蛋白酶切割融合蛋白,SDS-PAGE电泳检测纯化蛋白在约76 kDa处有一明显条带。以粗酶液处理直链淀粉,并采用淀粉酶水解上述反应液,发现反应液中含有较高的抗葡萄糖淀粉酶水解的淀粉。经TLC检测,证实了诱导表达的粗酶液能够催化直链淀粉环化成大环糊精。（3）优化了E.coli BL21/pET-GST-Mal Q的产酶工艺条件。最佳诱导条件为诱导时间5 hr,诱导温度35℃,初始细胞量（OD6000.8）,诱导剂IPTG终浓度0.9mmol/L,转速150 rpm。在最佳诱导条件下,基因工程菌的酶活达2.84 U,而Streptomyces ssp. ST66的酶活仅为0.31 U,基因工程菌产酶的酶活提高了9.16倍。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 大环糊精及其研究进展
• 1.1.1 大环糊精概述
• 1.1.2 大环糊精的命名
• 1.1.3 大环糊精的结构性质
• 1.1.4 大环糊精的检测鉴定
• 1.1.5 包合物
• 1.1.6 大环糊精的应用与展望
• 1.2 大环糊精制备用酶的研究进展
• 1.3 大肠杆菌表达系统
• 1.3.1 表达载体pET-GST
• 1.3.2 表达宿主菌E.coli BL21
• 1.3.3 外源蛋白在大肠杆菌中表达的影响因素
• 1.4 本研究的内容和意义
• 第二章 基因工程菌的构建
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 主要试剂、培养基和常见溶液配制
• 2.1.3 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 菌株培养
• 2.2.3 Streptomyces ssp. ST66基因组提取
• 2.2.4 pET-GST质粒提取
• 2.2.5 麦芽糖转糖基酶基因的PCR扩增
• 2.2.6 DNA的双酶切
• 2.2.7 重组质粒的构建
• 2.2.8 感受态细胞制备
• 2.2.9 连接产物的转化
• 2.2.10 阳性克隆子的筛选
• 2.2.11 DNA测序
• 2.2.12 表达用工程菌的构建和诱导表达
• 2.2.13 麦芽糖转糖基酶活性分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 基因组DNA的提取
• 2.3.2 PCR扩增麦芽糖转糖基酶基因
• 2.3.3 质粒pET-GST提取
• 2.3.4 重组阳性克隆子筛选
• 2.3.5 Mal Q基因测序
• 2.3.6 表达用基因工程菌的构建及初步诱导表达
• 2.3.7 酶活力测定
• 2.4 小结
• 第三章 麦芽糖转糖基酶的初步纯化与鉴定
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 主要生化试剂和仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 粗酶液的制备
• 3.2.2 Ni-NTA柱亲和色谱
• 3.2.3 SDS-PAGE检测
• 3.2.4 淀粉环化实验
• 3.2.5 抗葡萄糖淀粉酶淀粉的测定
• 3.2.6 薄层色谱分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 阳性重组质粒pET-GST-Mal Q诱导表达SDS-PAGE分析
• 3.3.2 亲和色谱纯化目标蛋白
• 3.3.3 环化反应液的抗葡萄糖淀粉酶处理分析
• 3.3.4 薄层色谱检测
• 3.4 本章小结
• 第四章 基因工程菌发酵产酶的研究
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 主要生化试剂和仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 E.coli BL21/pET-GST-Mal Q生长曲线的测定
• 4.2.2 葡萄糖标准曲线的测定
• 4.2.3 酶活的测定
• 4.2.4 E.coli BL21/pET-GST-Mal Q的诱导培养和酶液收集
• 4.2.5 薄层色谱检测Amylomaltase的表达
• 4.2.6 不同诱导时间的影响
• 4.2.7 不同诱导温度的影响
• 4.2.8 不同IPTG（诱导剂）浓度的影响
• 600的影响'>4.2.9 不同诱导前OD₆₀₀的影响
• 4.2.10 不同培养转速的影响
• 4.2.11 优化诱导发酵条件下基因工程菌产酶
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 生长曲线的绘制
• 4.3.2 诱导时间对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响
• 4.3.3 诱导温度对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响
• 4.3.4 IPTG浓度对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响
• 600对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响'>4.3.5 诱导前OD₆₀₀对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响
• 4.3.6 诱导转速对E.coli BL21/pET-GST-Mal Q发酵产酶影响
• 4.3.7 优化诱导发酵条件下基因工程菌产酶分析
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 表达载体pET-GST
• 攻读学位期间的研究成果