基于多种分析技术的胰腺癌与糖尿病血清代谢组学研究

论文摘要

胰腺癌（Pancreatic cancer）是常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率占人类全身肿瘤的1-3%,在西方国家居恶性肿瘤死亡原因的第四位,早期诊断困难。胰腺癌与糖尿病有着密切关系,探索两者发病机制的联系,将有助于了解胰腺癌的病因,并为提高癌症早期诊断率提供依据。代谢组学从系统水平研究机体小分子代谢产物变化规律,在研究疾病发病机制和早期诊断等方面有一定优势。本论文将加压毛细管电色谱（pCEC）应用于血浆代谢组学研究,证明了该技术高效分离血浆内源性代谢物的能力,以及作为胰腺癌早期诊断手段的可行性。进一步分别应用以UPLC/MS和GC/MS为基础的代谢组学技术,从整体上考察胰腺癌、糖尿病和正常人血清间的代谢物差异,发现可获得较多两种疾病间共有和特异性的标志物,为将来全面理解两种疾病在发病机制上的差异和联系提供了一个新视角和实验基础。同时,根据代谢组学数据具有非线性的特点,探讨了非线性人工神经网络对三组样本进行分类的能力,说明该技术有潜力用于大样本量的模式识别。本论文主要内容包括:1、建立pCEC研究血浆代谢指纹图谱的方法,考察该方法区分胰腺癌患者的能力。以反相色谱柱和梯度洗脱对血浆样品进行pCEC分离。通过考察流动相组成、检测波长、酸改性剂和操作电压对质控（QC）血浆样品分离情况的影响优化色谱条件。通过对重复进样的QC样品进行考察,说明该方法重复性好、系统稳定性高。另外,比较了pCEC-UV数据经不同标准化方法预处理后,对正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型的影响。研究发现,pCEC-UV分析得到的血浆代谢指纹图谱能明显表征出胰腺癌患者和正常人的代谢表型差异,结合有监督模式识别,能够有效的区分胰腺癌患者和健康对照组的血浆代谢轮廓。本研究说明pCEC-UV技术可以作为一种经济环保、高效和相对简单的技术平台用于疾病的血浆代谢谱研究,是一种潜在的早期诊断手段。2、采用超高压液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（UPLC Q-TOF MS）技术分析了20个胰腺癌患者、19个2型糖尿病患者和25个正常人血清的代谢组学差异,结合非监督的PCA方法,发现三组样本的代谢谱有分离趋势。进一步利用有监督的OPLS-DA方法能清楚地将三组样本分开,说明相对于正常人而言,胰腺癌患者和糖尿病人的代谢谱均发生改变,并有明显差异。根据精确分子量、同位素信息和MS/MS信息,按照差异代谢物的种类,对其进行了系统的鉴定,尤其是对血清中检测到的溶血磷脂酰胆碱（lysoPC）的同分异构体进行了全面鉴定。与正常人相比,胰腺癌患者血清中以甘氨鹅脱氧胆酸为代表的4种胆汁酸明显升高,12种lysoPC（包括部分同分异构体）降低,花生四烯酸以及部分脂肪酸升高;糖尿病患者血清中同样的12种lysoPC显著降低,而花生四烯酸等游离脂肪酸降低。胰腺癌与糖尿病在磷脂代谢和脂肪酸代谢均发生了紊乱,但是lysoPC18:1同分异构体的比例变化在两种疾病中存在差异,提示将来通过对具体种类的lysoPC同分异构体进行定量分析可能会发现胰腺癌与糖尿病的特异性差异标志物。3、采用气相色谱质谱（GC-MS）技术分析了20个胰腺癌患者、19个2型糖尿病患者和25个正常人血清的代谢组学差异。以N-O-双（三甲硅基）三氟乙酰胺（BSTFA）为衍生试剂,采用两步法对血清样品进行衍生,同时优化了甲氧胺的加入量。结合PCA和OPLS-DA对数据进行模式识别,得到了与UPLC-MS代谢组学分析类似的结果,能够清晰的区分三组样本的血清代谢组差异。实验检测得到的差异物与UPLC-MS互补,主要为氨基酸类、糖类、胆固醇以及有机酸等物质。与正常人相比,胰腺癌与糖尿病患者的糖代谢、糖酵解以及部分氨基酸代谢均发生了不同程度的紊乱。亮氨酸、十六烷酸以及苯丙氨酸在胰腺癌组特异性上调,甘氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、脯氨酸、柠檬酸则在糖尿病患者血清中特异性下调,提示这些小分子物质可能分别为两种疾病的潜在特异性生物标志物。4、以UPLC/MS实验得到的26个差异物在各个样本中的响应强度为数据基础,采用非线性人工神经网络建立多类型样本的分类模型。通过试验比较不同隐含层数和隐含层结点数对网络收敛性及血清分类结果的影响。试验发现网络层数过少的三层前馈网络不足以准确地对胰腺癌患者、糖尿病患者和正常人血清样本进行分类,分类准确率仅为86.7%,而具有最优网络结构的四层前馈网络{26,9,7,3}的分类准确率高达96.7%。在具有充足样本数量的条件下,有监督的人工神经网络可望成为代谢组学研究中一个有力的分类工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 课题背景介绍
• 1.1.1 胰腺癌的概述
• 1.1.2 胰腺癌的病理
• 1.1.3 糖尿病与胰腺癌的关系
• 1.1.4 代谢组学介绍
• 1.1.5 代谢组学研究方法及进展
• 1.1.6 代谢组学在临床研究中的应用
• 1.1.7 代谢组学新研究策略
• 1.2 本研究的意义与研究内容
• 1.2.1 本课题的研究意义
• 1.2.2 本课题的研究内容
• 参考文献
• 第二章 加压毛细管电色谱法用于胰腺癌患者血浆代谢指纹图谱的方法学研究
• 2.1 引言
• 2.2 仪器与试剂
• 2.2.1 仪器
• 2.2.2 试剂
• 2.3.3 样本的采集
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 血清样品预处理
• 2.2.2 加压毛细管电色谱条件
• 2.2.3 数据预处理与模式识别
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 色谱条件的优化
• 2.3.2 方法学验证
• 2.3.3 胰腺癌与正常人的代谢谱比较
• 2.3.4 胰腺癌与正常人多维统计分析
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 基于UPLC Q-TOF MS 的胰腺癌与糖尿病血清代谢组学研究
• 3.1 引言
• 3.1 仪器与试剂
• 3.1.1 仪器
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 样本的采集
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 血浆样品预处理
• 3.2.2 色谱条件
• 3.2.3 质谱条件
• 3.2.4 数据预处理和多维统计分析
• 3.2.5 差异代谢物鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 分析方法验证
• 3.3.2 患者和正常人血清UPLC Q-TOF MS 分析的基峰离子流图比较
• 3.3.3 总体样本PCA 模型结果
• 3.3.4 总体样本OPLS-DA 模型结果
• 3.3.5 OPLS-DA 区分两两组别的结果
• 3.3.6 潜在标志物的选择
• 3.3.7 潜在标志物的鉴定
• 3.3.8 相关代谢网络的探讨
• 3.5 本章小结
• 参考文献
• 第四章 基于GC MS 的胰腺癌与糖尿病血清代谢谱研究
• 4.1 引言
• 4.2 仪器与试剂
• 4.2.1 仪器
• 4.2.2 试剂
• 4.2.3 样本采集
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 血清代谢物的预处理及衍生
• 4.3.2 衍生反应条件的选择
• 4.3.3 色谱质谱条件
• 4.3.4 数据处理方法
• 4.3.5 差异物鉴定
• 4.4 结果与讨论
• 4.4.1 衍生化方法的比较
• 4.3.2 方法学验证
• 4.3.3 患者和正常人血清GC MS 指纹图谱比较
• 4.3.4 多维统计分析结果
• 4.3.5 差异物分析
• 4.3.4 相关代谢网络的探讨
• 4.5 本章小结
• 参考文献
• 第五章 人工神经网络在胰腺癌与糖尿病模式识别中的应用研究
• 5.1 引言
• 5.2 人工神经网络基础
• 5.2.1 神经网络的特点
• 5.2.2 神经网络的结构
• 5.2.3 神经网络学习
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 实验样本和数据
• 5.3.2 数据处理方法
• 5.4 人工神经网络在胰腺癌与糖尿病模式识别中的应用
• 5.4.1 三层前馈网络
• 5.4.2 四层前馈网络
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 第六章 研究总结与展望
• 6.1 研究工作总结
• 6.2 全文结论
• 6.3 论文创新点
• 6.4 研究展望
• 致谢
• 博士期间已发表和待发表论文