VA分离、检测与毒性分析及其作为AFT预警报告分子可行性研究

论文摘要

目的:黄曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）和杂色曲霉素（Sterigmatocystin,ST）是众所周知的毒性极强的真菌毒素。在食品安全方面,其为进出口贸易之必检项目,而且也建立了国际性之最高残留限量要求标准（MRL值）,如果可以建立一个预警检测方案将能够在毒素未产生前即获得危险性报告,而有机会及时采取措施避免进一步的经济损失。而要建立预警（predict）检测的手段需要选定一个毒素的生物指示分子（biomarker）。方法:1)建立（Versicolorin A,VA）的HPLC检测方法,包括VA标准品的分离、纯化制备和鉴定。2)对VA的毒性进行评价,把纯化之VA标准品进行毒理学实验。以Ames试验和人体外周淋巴细胞微核实验进行。3)对纯培养的黄曲霉和寄生曲霉以及感染了寄生曲霉的大米样品检测其VA和ST及AFTB1的产出情况。本项目的关键问题和工作难点在于VA标准品的纯化制备,以及获得足够的VA以用于毒性的分析和评价。计划利用可积累VA的寄生曲霉诱变菌株。并使用了分析型高效液相色谱仪、制备型高效液相色谱仪和高效液相质谱仪的现代检测技术。结果:1)本文成功地纯化出纯度达98%以上的VA标准品20mg。2)毒理学实验显示Ames试验呈阳性结果:VA 2.5μg/皿S9+,5μg/皿S9-（TA98）。而在人体外周淋巴细胞微核实验在4800nmol/L时呈阳性结果,表明VA为一遗传毒物。3)纯培养的黄曲霉和寄生曲霉在各培养基上,VA均能够在第7天和第10天稳定地检测到,AFTB1仅在PG培养基上,第10天才被检测到。在染毒大米（寄生曲霉）样品中,27℃下,第5、7、10天均可检测到VA而AFTB1要到第14天才能够被检测到（TLC法）。在28℃下,第3、5、7、10天均可检测到VA,而AFTB1在第7天才开始检测到（HPLC法）。结论:建立了用HPLC方法检测VA的手段。VA作为黄曲霉毒素的预警报告分子是可行的。VA显示致畸变毒性。Ames试验显示在鼠肝微粒体存在或不存在下均呈阳性（S9+2.5μg/皿,S9-5μg/皿）;人体外周淋巴细胞微核实验显示VA遗传毒性呈阳性（1.6μg/ml）。因此,粮食样品中检出VA意味着该样品存在着高危险性的AFTB1污染,而且该样品已被毒素污染虽然此时可能未检出AFTB1。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 真菌毒素（黄曲霉毒素Aflatoxin,杂色曲霉素Sterigmatocystin）之简介
• 1.1.1 黄曲霉毒素（Aflatoxin,AFT）
• 1.1.2 杂色曲霉素（Sterigmatocystin,ST）
• 1.1.3 现行的AFT与ST检测的不足之处
• 1.2 黄曲霉毒素预警检测之研究意义
• 1.3 本课题研究的内容
• 1.3.1 建立（Versicolorin A,VA）的监测手段—HPLC检测方法的建立
• 1.3.2 VA毒性的评价
• 1.3.3 黄曲霉/寄生曲霉产VA与ST、AFT的时间过程
• 1.4 实验的设计方案及方法的可行性
• 1.5 技术路线
• 1.6 本课题的创新性及困难点
• 第二章 方法与材料
• 2.1 建立VA的监测手段—HPLC检测方法的建立
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 实验材料
• 2.1.3 主要试剂和配方
• 2.1.4 VA标准品的分离纯化与鉴定
• 2.1.4.1 寄生曲霉诱变株培养与VA之提取方法
• 2.1.4.2 VA之分离纯化和鉴定
• 2.1.5 VA之HPLC检测手段的建立
• 2.2 VA毒性的评价
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 实验材料
• 2.2.3 主要试剂和配方
• 2.2.4 VA毒性评价的方法与步骤
• 2.2.4.1 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验（Ames test）
• 2.2.4.2 人体外周血淋巴细胞微核试验
• 2.3 黄曲霉/寄生曲霉产VA与ST、AFT的时间过程
• 2.3.1 主要仪器
• 2.3.2 实验材料
• 2.3.3 主要试剂和配方
• 2.3.4 VA之TLC监测方法
• 2.3.4.1 VA在培养基中的监测
• 2.3.4.2 在感染产毒霉菌的粮食（大米）样品中的监测
• 2.3.5 在感染产毒霉菌的粮食（大米）样品中VA之HPLC监测
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 建立VA的监测手段—HPLC检测方法建立的结果与讨论
• 3.1.1 寄生曲霉诱变菌株培养与VA之提取结果及分析
• 3.1.2 VA之制备和鉴定结果及讨论
• 3.2 VA毒性的评价的结果与讨论
• 3.2.1 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验（Ames test）数据
• 3.2.2 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验（Ames test）图片
• 3.2.3 鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体试验（Ames test）结果及分析
• 3.2.4 人体外周血淋巴细胞微核试验数据
• 3.2.5 人体外周血淋巴细胞微核试验图片
• 3.2.6 人体外周血淋巴细胞微核试结果及分析
• 3.3 黄曲霉/寄生曲霉产VA与ST、AFT时间过程的结果及分析
• 3.3.1 VA在培养基中的TLC监测
• 3.3.2 VA在感染了产毒霉菌的粮食（大米）样品的TLC监测
• 3.3.3 VA在感染了产毒霉菌的粮食（大米）样品的HPLC监测
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 建立VA的监测手段—HPLC检测方法的建立
• 4.2 VA毒性的评价
• 4.3 黄曲霉/寄生曲霉产VA与AFT的时间过程
• 第五章 总结与展望
• 1、杂色曲霉素ST、杂色曲菌毒素VA化学鉴别信息'>附录Ⅰ 黄曲霉毒素AFTB₁、杂色曲霉素ST、杂色曲菌毒素VA化学鉴别信息
• 1、杂色曲霉素ST、杂色曲菌毒素VA毒理学数据资料'>附录Ⅱ 黄曲霉毒素AFTB₁、杂色曲霉素ST、杂色曲菌毒素VA毒理学数据资料
• 参考文献
• 致谢