论文摘要
氧化亚氮（N2O）是重要的温室气体之一,也是目前最重要的臭氧层破坏物质。作为产生N20主要过程之一的反硝化作用,逐渐受到广大研究者们的关注。青藏高原高寒沼泽化草甸作为N2O气体的源与汇对温室效应具有显著影响,它同时也是许多珍稀野生动物的栖息地,在保障该地区畜牧业生产和调节黄河径流上具有重要而独特的作用,是人类极为重要的环境资源。然而,近年来由于自然及长期超载放牧等人为因素,导致青藏高原高寒沼泽化草甸严重退化,植被覆盖度明显下降,这不仅破坏了当地藏民赖以生息的草地畜牧业的发展,也将对整个青藏高原及其下游地区生态环境产生不利的影响。本文采用构建克隆文库与实时荧光定量PCR技术相结合研究了青藏高原高寒沼泽化草甸反硝化微生物群落结构多样性及其丰度与长期不同放牧强度管理间的关系进行了研究。实验共设置完全禁牧（F1）、季节性放牧（F2）和四季放牧（F3）三个处理。结果如下：一、长期不同放牧强度管理对反硝化微生物群落丰度的影响实时荧光定量PCR结果显示,随着放牧强度的增加,nirK型反硝化细菌的丰度均呈现递增的趋势。不同放牧强度处理下nirK基因拷贝数在2.08×105-1.32×106 copies g-1 dry soil之间,与不放牧的处理相比,放牧增加了nirK基因的拷贝数,五月份不同放牧强度处理下nirK基因拷贝数在1.01×106～1.32×106 copies g-1 dry soil之间,随着放牧强度的增加不同放牧处理间nirK基因的拷贝数并没有发生显著的变化（P>0.05）；七月份不同放牧强度处理下nirK基因拷贝数在2.08×105～5.82×105 copies g-1 dry soil之间,与完全禁牧的处理相比,放牧显著增加了nirK基因的拷贝数,完全禁牧（F1）处理下的样品土壤中nirK基因拷贝数明显低于季节性放牧和四季放牧（P<0.05）。基于nirS基因的实时荧光定量PCR结果显示,放牧对高寒沼泽化草甸土壤中nirS型反硝化细菌的丰度没有显著影响（P>0.05）。不同放牧处理下nirS基因拷贝数在3.86×107～9.67×107 copies g-1 dry soil之间,与完全禁牧的处理相比,放牧降低了nirS基因的拷贝数,但是随着放牧强度的增加不同放牧强度处理下nirS基因拷贝数没有发生显著的变化0>0.05)。由此可见,nirK型和nirS型反硝化微生物对长期不同放牧强度管理具有不同的响应模式,与nirS基因相比,nirK基因更加敏感。不同放牧强度的处理中,nirK基因的拷贝数存在月份间的显著性差异（P<0.05）,五月份nirK基因的拷贝数是七月份的2.7倍,而nirS基因的拷贝数在不同月份的差异并不显著（P>0.05）。研究结果表明在不同放牧强度的处理中nirS基因的拷贝数比nirK基因的拷贝数要高出1-2个数量级。Pearson相关性分析表明,nirK和nirS基因拷贝数与土壤理化性质间的关系随月份的变化而改变,nirK基因拷贝数仅在五月份与土壤pH和速效磷含量呈显著正相关（P<0.05）,七月份,所有土壤理化性质与nirK基因拷贝数均不相关；而nirS基因拷贝数在五月份与全磷、全碳以及硝态氮呈显著相关（P<0.05）,七月份,与全碳和全氮呈显著正相关（P<0.05）。二、长期不同放牧强度管理对反硝化菌群落结构的影响不同放牧强度处理下nirK和nirS型反硝化菌群落多样性单因素方差分析（ANOVA）显示,长期放牧改变了青藏高原高寒沼泽化草甸土壤中反硝化细菌的群落结构。研究结果表明,五月份随着放牧强度的增加不同放牧强度处理之间nirK型反硝化菌群落多样性并没有发生显著的变化（P>0.05）：而七月份,四季放牧（F3）处理下的样品土壤中nirK型反硝化菌群落多样性明显高于季节性放牧和完全禁牧（P<0.05）。不同放牧处理中,nirS型反硝化菌群落多样性随放牧强度的增加呈现递增的趋势,但该变化并不显著（P>0.05）。nirK和nirS基因克隆文库结果显示：nirK和nirS型反硝化菌群落多样性存在月份间的差异,五月份样品土壤中nirK和nirS型反硝化菌群落多样性均要高于七月份。此外,研究结果表明在不同放牧处理中,nirS型反硝化菌群落多样性要高于nirK型反硝化菌。系统发育分析显示,长期不同放牧强度管理对nirK和nirS型反硝化菌群落结构的影响具有季节的特异性。nirK基因序列共划分为5个Cluster,其中ClusterI是优势类群（74.76%～97.31%）。五月份,nirK型反硝化菌优势类群Cluster I随着放牧强度的增加,呈现递增的趋势,该类群在四季放牧（F3）的土壤样品中所占的比例要明显高于完全禁牧（F1）和季节性放牧（F2）（P<0.05）；七月份,nirK型反硝化菌优势类群Cluster I在季节性放牧（F2）土壤样品中所占的比例要明显高于完全禁牧（F1）和四季放牧（F3）（P<0.05）。nirS基因序列共划分为7个Cluster类群,五月份,放牧改变了样地土壤中的优势类群,在完全禁牧（F1）的土壤样品中Cluster V （46.65%）是优势类群,而在季节性放牧（F2）和四季放牧（F3）的土壤样品中则是Cluster I占主导优势（28.73%-34.62%）；七月份在完全禁牧（F1）的土壤样品中Cluster V类群所占的比例明显高于季节性放牧（F2）和四季放牧（F3）（P<0.05）,在完全禁牧（F1）和四季放牧（F3）的土壤样品中Cluster V是优势类群（39.87%～61.48%）,而在季节性放牧（F2）的土壤样品中Cluster I占主导优势（35.23%）。综上所述,长期不同放牧强度管理影响了nirK和nirS型反硝化菌的群落结构和丰度,nirK型和nirS型反硝化菌对放牧强度具有不同的响应模式,与nirS基因相比,nirK基因更加敏感；青藏高原高寒沼泽化草甸土壤中nirS型反硝化菌群落多样性和丰度均高于nirK型反硝化菌；青藏高原高寒沼泽化草甸土壤中反硝化微生物群落结构和丰度随着采样时间的变化而具有明显的季节性变化。