论文摘要
恶性肿瘤危害巨大,但恶性肿瘤的三大传统疗法-手术、放疗和化疗,治疗效果不尽人意。随着对肿瘤免疫理论的深入认识和一些新的实验方法的涌现,肿瘤疫苗已成为预防和治疗肿瘤转移、复发的有力手段。但由于机体免疫网络的复杂性、肿瘤异质性、疫苗生物利用度差等问题,使得现有肿瘤疫苗的免疫效果并不理想。黑色素瘤抗原（Melanoma Antigen,MAGE）是第一个被发现的人类肿瘤特异性抗原,MAGE3是MAGE家族的重要成员之一,在多种不同类型恶性肿瘤中均有表达,在正常组织细胞（除睾丸、胎盘外）不表达;且MAGE3可与人类白细胞抗原（Human Leukocytes Antigen,HLA）分子结合形成抗原复合物,此抗原复合物可被细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte,CTL）的T细胞受体（T cell receptor,TCR）所识别,诱导特异性CTL的杀伤作用,是肿瘤特异性免疫治疗理想的靶分子。热休克蛋白（Heat Shock Protein,HSP）具有分子伴侣作用,参与肿瘤抗原的加工递呈,在诱导肿瘤免疫反应中发挥着重要作用;本室研究表明,HSP70与MAGE3融合蛋白能提高MAGE3蛋白疫苗的免疫效果。纳米载药系统与传统载药系统相比有很多优点,可有效解决蛋白质药物的生物利用度差的问题,目前已经有许多深入而广泛的研究。本研究以纳米脂质体包裹肿瘤特异性抗原MAGE3与热休克蛋白HSP70的融合蛋白（MH）,制备出纳米脂质体疫苗NL（MH）,着重对其抗肿瘤转移与复发作用进行研究,为该纳米疫苗临床前研究奠定基础。一纳米脂质体疫苗制备目的:制备无明显毒性、高效的恶性肿瘤基因工程纳米疫苗。方法:纯化融合蛋白MH,薄膜分散-超声法制备包裹MH的纳米脂质体肿瘤疫苗NL（MH）,并评价其粒径、包裹率及稳定性;观察NL（MH）免疫组小鼠的急性毒性反应,及重要脏器的病理学改变。结果:①成功制备出粒径为80±25 nm的纳米脂质体,其药物包裹率为30%,于4℃放置6个月后或3000rpm 10分钟离心后无分层,证明其稳定性良好;②与PBS对照组相比,免疫组小鼠未见明显毒性反应。结论:该恶性肿瘤基因工程纳米疫苗具有良好的理化性质,未见毒性反应。二纳米疫苗预防和治疗肿瘤转移和复发效应研究目的:在小鼠体内观察纳米疫苗预防和治疗肿瘤肺转移及预防肿瘤复发的作用。方法:以PBS、空白脂质体、MH、MH /NL、NL（MH）免疫C57BL/6小鼠3次后,IFN-γELISPOT和LDH杀伤试实验检测纳米疫苗激活小鼠特异性细胞免疫反应的情况;以实验性肺转移模型和自然肺转移模型评价纳米疫苗预防和治疗肿瘤转移作用;以肿瘤攻击实验和肿瘤切除后复发实验来评价纳米疫苗预防肿瘤复发作用。结果:与其它组相比,NL（MH）组小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的T细胞数量明显增多（P<0.05）,CTL对B16-MAGE3细胞具有显著的特异性杀伤作用;在预防和治疗肿瘤肺转移实验中,与其它组小鼠相比,NL（MH）免疫组小鼠B16-MAGE3肿瘤肺脏转移结节数明显减少（P<0.05）;在肿瘤攻击实验中,NL（MH）组B16-MAGE3肿瘤成瘤时间长、成瘤率低;肿瘤切除后复发实验中,NL（MH）组B16-MAGE3肿瘤复发时间延迟,复发率明显降低。结论: NL（MH）能够刺激机体产生强烈的MAGE3特异性的细胞免疫反应,对表达MAGE3的肿瘤细胞具有显著的杀伤作用,能有效预防和治疗B16-MAGE3肿瘤转移及预防肿瘤切除后复发。综上所述,本研究成功制备出粒径为80±25nm的纳米脂质体疫苗NL（MH）,其稳定性良好;NL（MH）能诱导机体产生强烈的MAGE3特异性CTL,对表达MAGE3肿瘤转移和复发具有良好的治疗和预防作用,对表达MAGE3肿瘤复发具有良好的预防作用。本研究为研制使用安全、高效的肿瘤疫苗展示了良好的前景,为本疫苗的临床前研究奠定了基础。