乐果对大鼠肝脏氧化应激状态和肝细胞凋亡的研究

论文摘要

为探讨低浓度乐果对大鼠肝脏氧化应激状态和肝细胞凋亡的影响及其机理,本试验通对大鼠肝脏病理组织和超微结构的观察及肝脏AChE、抗氧化酶和脂质过氧化指标的检测,研究了亚慢性染毒条件下乐果对大鼠肝脏氧化应激状态的影响;同时,通过体外原代培养肝细胞,研究了乐果对肝细胞的一般毒性和凋亡的影响。细胞凋亡用Annexin-V/PI双染法检测,细胞内活性氧、线粒体膜电位和细胞内Ca2+浓度变化,分别用DCFH-DA、罗丹名123和Fluo-2-AM标记检测,并探讨了以上因素在乐果诱导肝细胞凋亡中的可能机制。试验结果表明,分别灌服0、1、6和30mg/kg b.w.乐果染毒30d后,血浆和肝脏AChE活性降低,但并无明显的临床症状,推测中毒症状的出现不仅与血浆AChE活性降低程度有关,更主要与AChE降低速度有关。同时,各染毒组大鼠肝脏SOD活性均明显升高,而GSH-Px、CAT活性变化随染毒剂量增加呈先下降后上升趋势。脂质过氧化产物MDA含量呈上升趋势,与对照组相比,MDA含量分别升高29%、69%和129%。组织学和超微结构变化显示肝小叶充血、脂肪变性、肝细胞核皱缩、裂解,形成凋亡小体等。表明低剂量乐果亚慢性暴露不仅可造成大鼠肝脏氧化应激状态升高,且可造成肝脏一定程度的损伤。体外试验结果表明,0、3、30、300μmol/L乐果染毒12、24h均可不同程度抑制肝细胞的增殖,且存在时间-剂量效应。与对照组相比,染毒后48h达到生长高峰时,染毒组细胞存活率分别为对照组的85%、72%和67%,且随染毒时间延长,细胞活率进一步下降。细胞培养液上清中LDH含量升高,与对照组相比差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01）,300μmol/L组染毒12h和24h培养液上清中LDH含量分别为对照组的7.35倍和8.75倍;染毒组细胞内GSH含量降低,30和300μmol/L组与对照组差异极显著（P<0.01）。本研究表明,不同浓度乐果染毒后,细胞凋亡率明显升高,与对照组相比差异极显著（P<0.01）,并且呈时间-剂量效应。细胞内ROS水平在3-100μmol/L范围内随染毒剂量的增大和染毒时间的延长而升高,而在300μmol/L组略有下降。细胞内线粒体膜电位（Δψm）除24h高剂量染毒组（300μmol/L）外均出现持续下降。3μmol/L组细胞内Ca2+浓度极显著高于对照组（P<0.01）,但随染毒剂量的进一步增加,细胞内Ca2+浓度逐渐下降。表明乐果诱导的细胞凋亡可能与细胞内ROS生成及细胞膜的损伤有关。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 第一节 有机磷农药毒理学研究进展
• 1.1 OPs 在体内的代谢
• 1.2 OPs 的作用机制
• 1.3 OPs 毒理学研究进展
• 第二节 肝细胞凋亡机制研究进展
• 2.1 死亡受体介导的肝细胞凋亡
• 2.2 线粒体损伤诱导的肝细胞凋亡
• 2.3 ROS 在肝细胞凋亡中的作用
• 第三节 有机磷农药与氧化应激
• 第二章乐果亚慢性暴露对大鼠肝脏氧化应激状态的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 试验动物及其处理
• 1.3 肝脏组织病理学和超微结构变化观察
• 1.4 血浆和肝脏组织匀浆中AChE 的测定
• 1.5 肝脏组织匀浆中抗氧化酶和MDA 浓度的测定
• 1.6 数据处理
• 2 结果
• 2.1 肝脏病理组织学和超微结构变化
• 2.2 血浆、肝脏组织匀浆乙酰胆碱酯酶（AChE）活性变化
• 2.3 肝脏组织匀浆中抗氧化酶的变化
• 2.4 肝脏组织匀浆中MDA 含量的变化
• 3 讨论
• 第三章 乐果对大鼠原代培养肝细胞的一般毒性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果
• 2.1 原代培养肝细胞的形态
• 2.2 肝细胞鉴定
• 2.3 细胞生长曲线的绘制
• 2.4 细胞LDH 漏出率的测定
• 2.5 细胞内GSH 含量的测定
• 3 讨论
• 第四章 乐果对大鼠原代培养肝细胞凋亡的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂和仪器
• 1.2 试验方法
• 2. 结果
• 2.1 乐果对肝细胞凋亡率的影响
• 2.2 细胞内活性氧含量变化
• 2.3 细胞内线粒体膜电位（Δψm）的变化
• 2+浓度的影响'>2.4 乐果对细胞内Ca²⁺浓度的影响
• 3 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢