小鼠树突状细胞瘤转移相关基因的研究和生物信息学分析

论文题目: 小鼠树突状细胞瘤转移相关基因的研究和生物信息学分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物医学工程

作者: 周士新

导师: 陆祖宏

关键词: 小鼠树突状细胞瘤,基因表达谱,肿瘤转移,甲基化,聚类分析,主成分分析,同源异型基因,转录因子,胚胎干细胞

文献来源: 东南大学

发表年度: 2005

论文摘要: 恶性肿瘤细胞向其他组织或器官转移是肿瘤的一个基本特征,也是恶性肿瘤难以治愈的关键原因,人们目前对于肿瘤的转移机制和影响转移的基因了解的还不很清楚,特别是不同肿瘤细胞的转移机制和影响其转移的关键基因存在一定的差异。恶性肿瘤的转移涉及到多阶段改变的过程,其中包括:局部侵袭、血流转运、溢出、增殖、定着靶器官等,这些过程包含多种基因的复杂变化。我们利用从小鼠树突状细胞瘤(DCS)分离出来的肺转移能力明显差异的两株亚克隆细胞株,采用高密度的Affymetrix基因芯片检测这两株细胞的基因表达谱,用生物信息学的方法分析基因表达数据,获取表达显著差异的基因,进行了以下几方面的研究:1.小鼠树突状细胞瘤转移相关基因的研究小鼠树突状细胞瘤(DCS)是中国医学科学院(协和医科大学)基础医学研究所细胞中心所建的细胞系,他们用极限稀释方法从小鼠DCS母细胞系中分离到与同一母细胞来源的,转移能力明显差异的DD1和DG6细胞株,为消除细胞种群等其他因素的影响,专门研究DCS与肿瘤转移相关基因提供了良好的细胞模型。我们用高密度的Affymetrix基因表达芯片(小鼠MOE-430A),比较两株细胞基因表达的差异,高通量地筛选出可能与小鼠DCS肺转移相关的基因。结果发现,高转移细胞株DD1和低转移细胞株DG6在转录因子、RNA过程、细胞增殖和凋亡、分子转运和蛋白质修饰等方面均存在差异;通过RT-PCR和细胞免疫荧光试验,在RNA和蛋白质水平上我们验证了影响细胞分化的转录因子Ehf、凋亡相关基因Pedf、细胞粘附因子Nectin-3和趋化因子Mcp-1(CCL2)在这两株细胞中存在着显著的差异,提示这些基因可能与小鼠DCS肺转移相关。2. DNA甲基化与小鼠树突状细胞瘤的基因表达我们选择在高转移DD1和低转移DG6细胞株中表达差异较大一些转录因子Smcy,Ehf及与细胞凋亡Pedf、细胞粘附Nectin-3有关的基因,通过检测这些基因启动子区DNA甲基化情况,探讨是否由于DNA甲基化而控制这些基因的上调和下调,初步探寻影响小鼠DCS细胞基因表达的机制。我们采用亚硫酸氢盐处理高转移细胞株DD1和低转移细胞株DG6的基因组DNA后,用不含CG序列的特异性引物经PCR扩增出这几个基因的启动子序列,然后测序观察结果,CG序列中未甲基化的胞嘧啶C被转化胸腺嘧啶T,而甲基化的C保持不变。结果发现Pedf基因有一个位点的甲基化改变(C变为T);Smcy和Ehf基因启动子区的DNA甲基化模式没有明显改变,我们倾向认为,可能不是由于DNA甲基化控制这几个基因的高表达、低表达,而是其他原因如转录因子之间的相互作用影响这几个基因的上调或下调。3.小鼠树突状细胞瘤基因表达谱分析我们用Affymetrix基因表达芯片(小鼠MOE-430A)测定了小鼠树突状细胞瘤不同肺转移潜能的DD1和DG6细胞株的基因表达谱,同时我们从NCBI的基因表达数据库GEO和EBI的芯片数据库ArrayExpress at database下载了与树突状细胞(DC)发育相关的基因表达数据,下载的这些数据均是Affymetrix小鼠MG-U74av2芯片数据,我们用Affymetrix提供的两种芯片探针的匹配度筛选出最佳匹配的探针集,用内源的11个管家基因对2个自已测定的和32个从数据库下载的与DC发育相关的表达数据标准化,采用分层聚类分析、主成分分析、最近邻分析和自组织映射分析方法,将小鼠DD1和DG6细胞株的基因表达谱与数据库中树突状细胞(DC)发育各阶段的基因表达谱进行比较,结果发现小鼠树突状细胞瘤的基因表达谱与骨髓来源的造血干细胞和DC前体细胞相似,而与脾脏来源的相对成熟的DC差异较大,我们的结果支持肿瘤细胞来源于干细胞,干细胞发育障碍而导致肿瘤发生的理论,另外,结果还显示DD1和DG6基因表达谱与已知DC前体细胞的相似性,这个结果也提示合作单位分离的细胞为小鼠树突状细胞。4.含有同源异型结构的转录因子的生物信息学分析Affymetrix高密度表达芯片检测结果显示,高转移的DD1细胞株高表达同源异型基因En1(Engrailed 1 homeobox),低转移的DG6细胞株高表达lhx2(LIM homeobox protein 2)和prrx2(paired related homeobox 2)同源异型基因,提示同源异型基因与小鼠树突状细胞瘤可能有相关性。含有同源异型结构(homeobox)的蛋白在胚胎发育、基因表达调节、细胞分化、神经发生等方面发挥重要作用。同源异型结构的氨基酸残基在疏水性和带正电的氨基酸残基具有保守性,含有同源异型结构的蛋白质与基因启动子区富含A和T核酸序列结合。同源异型框与其它结构域同时存在,如PAX、POU、LIM、OAR、CUT、ELK、bZIP、SIX、PHD-finger、Engrailed等,近来还发现它通过基因融合或基因失调控方式参与肿瘤的发生,而且Nanog homeobox和OCT4(为POU复合homeobox结构)是胚胎干细胞维持自我更新过程所必需的。5.利用启动子区序列的同源性,寻找转录因子结合位点胰岛素启动因子1(IPF1,insulin promoter factor-1或PDX1,pancreatic duodenal homeobox-1)是含有同源异型结构(homeobox)蛋白质,和神经分化因子1(NDF1,neurogenic differentiation factor 1或NeuroD)、肝细胞核因子4(HNF4,hepatocyte nuclear factor 4)共同参与胰岛素基因表达的调控,均为MODY (maturity onset diabetes of the young)基因,这几个因子的功能缺陷是二型糖尿病发生重要的遗传因素。我们通过比较人、小鼠、大鼠这三种核蛋白氨基酸一级序列和结构域,发现其序列和结构十分相似,推测这些DNA结合蛋白与胰岛素基因结合的核苷酸序列相似;用ClustalW比较三者Promotor区的核苷酸序列,显示有几段核苷酸序列较为相似,同时搜索TRANSFAC基因转录数据库中NDF1、IPF1和HNF4蛋白核苷酸结合位点,发现核酸比对保守的部分序列与TRANSFAC数据库中这三个转录因子的DNA结合位点一致,另外一些核酸保守序列可能为其他未知DNA结合蛋白的结合位点。这为分子生物学实验寻找和验证新的胰岛素DNA结合蛋白与核苷酸的结合位点提供了基础。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

1.1 研究肿瘤转移的意义

1.2 高通量筛选与肿瘤转移相关基因的方法

1.2.1 差异显示技术

1.2.2 基因表达系列分析（SAGE）

1.2.3 基因表达芯片（DNA 微阵列）

1.3 基因表达分析原则和方法

1.4 小鼠基因表达的调控

1.4.1 DNA甲基化

1.4.2 转录因子的调控

1.4.3 组蛋白的甲基化或乙酰化

1.5 基因表达与转录因子的生物信息学分析

1.6 Affymetrix基因表达芯片的详细操作规程（见附录一）

1.7 我们的研究思路及本论文的结构

参考文献

第二章 小鼠树突状细胞瘤转移相关基因的研究

2.1 引言

2.2 材料和方法

2.2.1 主要试剂

2.2.2 试验仪器

2.2.3 细胞培养的方法和步骤

2.2.4 小鼠树突状细胞瘤DD1 和DG6 全基因组表达谱和统计学处理

2.2.5 逆转录PCR（RT-PCR）验证

2.2.6 细胞免疫荧光（蛋白质水平）的验证

2.2.6.1 免疫荧光技术简介

2.2.6.2 免疫荧光细胞染色的步骤

2.3 结果

2.3.1 基因表达芯片的质量控制

2.3.2 DD1 和DG6 细胞株全基因组表达差异的比较

2.3.3 DD1 和DG6 细胞株显著差异表达的基因GO 分类

2.3.4 部分DD1 和DG6 细胞株中表达差异显著基因的RT-PCR 验证

2.3.5 部分DD1 和DG6 差异基因的蛋白质水平(细胞免疫荧光)验证

2.4 讨论

参考文献

第三章 DNA 甲基化与小鼠树突状细胞瘤的基因表达

3.1 引言

3.2 小鼠 DD1 和 DG6 细胞基因组 DNA 的提取和纯化

3.2.1 试验器材

3.2.2 基因组 DNA 抽提原理

3.2.3 操作步骤

3.3 小鼠 DD1 和 DG6 细胞基因组 DNA 的转化

3.3.1 试验器材

3.3.2 试验步骤

3.4 PCR 扩增

3.4.1 试验器材

3.4.2 引物设计与 PCR 扩增

3.5 结果与与讨论

3.5.1 PCR结果

3.5.2 测序结果

3.6 结论

参考文献

第四章 小鼠树突状细胞瘤基因表达谱分析

4.1 引言

4.2 小鼠树突状细胞发育相关基因的表达数据处理

4.2.1 数据下载与预处理

4.2.2 数据标准化

4.2.3 数据筛选

4.3 分层聚类分析、SOM聚类分析和主成分分析

4.3.1 聚类分析简介

4.3.2 分层（层次）聚类法

4.3.3 自组织映射神经网络（SOM）聚类

4.3.4 主成分分析

4.4 结果与讨论

4.4.1 DC 细胞瘤和 DC 发育相关细胞的分层聚类分析

4.4.2 DC 细胞瘤和 DC 发育相关细胞的主成分分析

4.4.3 DC细胞瘤和DC发育相关细胞的最近邻分析

4.4.4 DC细胞瘤和DC发育相关细胞的SOM聚类分析

参考文献

第五章 含有同源异型结构的转录因子的生物信息学分析

5.1 同源异型基因在转移潜能不同的小鼠树突状细胞瘤中表达存在差异

5.2 同源异型结构的序列及 DNA 结合位点特征

5.2.1 数据来源

5.2.2 方法

5.2.3 结果

5.3 复合同源异型结构的类型、位置及结合的 DNA 序列特点

5.3.1 复合同源异型结构的类型

5.3.2 复合同源异型结构相对 HOX 的位置

5.3.3 复合同源异型结构的 DNA 结合序列的特点

5.3.4 复合同源异型框的功能

5.4 复合同源异型框与恶性肿瘤的关系

5.5 总结

参考文献

第六章 利用DNA启动子区序列的同源性寻找转录因子结合位点

6.1 数据来源

6.2 方法

6.2.1 人类和小鼠、大鼠 NDF1、IPF1 和 HNF4 蛋白氨基酸序列的比对

6.2.2 人类、小鼠、大鼠 NDF1、IPF1 和 HNF4 结构域分析

6.2.3 人类、小鼠、大鼠胰岛素基因Promoter区的核苷酸序列比较

6.2.4 转录因子在胰岛素基因启区与 DNA 的可能结合位点分析

6.3 结果

6.3.1 人类和小鼠、大鼠 NDF1、IPF1 和 HNF4 氨基酸序列的两两比对

6.3.2 人类、小鼠、大鼠 NDF1、IPF1 和 HNF4 的结构域

6.3.3 人类、小鼠、大鼠胰岛素基因 Promoter 区的核苷酸序列多重比对

6.3.4 转录因子在胰岛素基因 Promoter 区与 DNA 的可能结合位点分析

6.4 讨论

参考文献

总结

附录一 基因表达芯片的试验操作方案

附录二 小鼠树突状细胞瘤及高转移和低转移细胞株的鉴定

攻读博士学位期间发表的论文

致谢

发布时间: 2007-06-11

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