四翅滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）的克隆及其对烟草的遗传转化

论文摘要

土壤盐渍化是当今农业生产面临的一个全球性问题。通过农业生物技术培育耐盐植物新品种已成为利用盐渍土壤的研究热点。四翅滨藜为藜科滨藜属多年生常绿或准常绿灌木,具有耐干旱、耐严寒、耐贫瘠、抗盐碱等多种优良特性,现已被广泛用于牧场改良和水土保持。本研究从四翅滨藜中获取耐盐基因BADH的cDNA片段,构建其植物表达载体pBI121-BADH,采用农杆菌介导法再将其转入模式植物烟草,并进行PCR检测。取得的研究结果如下:1.采用异硫氰酸胍法对四翅滨藜叶片进行了总RNA的提取、纯化,琼脂糖凝胶电泳呈现了典型的28S、18S、5S三种RNA带型,后将其反转录成cDNA。2.根据GenBank中已发表的同科、同属植物三角叶滨藜BADH的cDNA全序列,应用Oligo6.0设计特异性引物,在5’端分别引入BamHⅠ和SacⅠ两个酶切位点,利用PCR技术获取耐盐基因甜菜碱醛脱氢酶基因（BADH）的cDNA片段,将其与pGEM-T Easy Vectors连接后转化E.coli DH5α,对获得的克隆子通过PCR、酶切检测后测序。与GenBank中同源序列进行比对分析表明与已知BADH基因核苷酸序列同源性高达95.92%。3.用BamHⅠ和SacⅠ双酶切pGEM-BADH和pBI121两种质粒DNA,分别回收BADH基因片段和除去了Gus基因的pBI121线状载体,连接、转化、获得重组质粒。对重组质粒经PCR、BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定,成功构建了CaMV35S启动子驱动的中间表达载体和植物表达载体pBI121-BADH。4.采用冻融法将植物表达载体pBI121-BADH导入根癌农杆菌EHA105的感受态中,获得工程菌株EHA105-pBI121-BADH。采用农杆菌介导的叶盘转化法再将其导入模式植物烟草,获得抗卡那霉素转基因植株,PCR鉴定转化成功。

论文目录

• 摘要
• SUMMARY
• 缩略词表
• 第一章 引言
• 1 盐分对植物的影响
• 2 植物的耐盐性
• 3 植物耐盐机理的研究
• 4 植物耐盐基因工程研究进展
• 5 植物甜菜碱合成酶基因研究进展
• 6 植物基因分离的方法
• 7 本研究的目的和意义
• 8 技术路线
• 第二章 四翅滨藜甜菜碱醛酸脱氢酶基因（BADH）的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料及处理
• 1.2 菌种和质粒
• 1.3 工具酶和试剂
• 1.4 方法
• 1.5 电泳滞后带检测
• 1.6 重组转化子的PCR、酶切鉴定
• 1.7 DNA 序列分析及同源性比较
• 2 结果与分析
• 2.1 总RNA 的完整性和纯度
• 2.2 BADH 基因PCR 扩增及回收
• 2.3 BADH 基因重组子蓝白斑筛选与电泳滞后检测
• 2.4 重组质粒的PCR、酶切鉴定
• 2.5 重组质粒测序结果及分析
• 3 讨论
• 3.1 总RNA 的提取
• 3.2 PCR 引物设计
• 3.3 测序结果
• 第三章 BADH 基因植物表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种和质粒
• 1.2 工具酶和试剂
• 1.3 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因和线性载体的准备
• 2.2 连接产物转化大肠杆菌
• 2.3 重组质粒PCR 和酶切鉴定
• 3 讨论
• 3.1 目的基因和线性载体的准备
• 3.2 重组质粒的鉴定
• 第四章 植物表达载体 pBI121-BADH 转化烟草
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂及菌种
• 1.2 植物材料
• 1.3 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 植物表达载体转化农杆菌
• 2.2 植物表达载体的PCR 检测
• 2.3 转化烟草及转化植株的分子检测
• 3 讨论
• 3.1 工程菌的鉴定
• 3.2 烟草转化
• 第五章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介
• 附录：BADH 基因测序结果